Organoid-fibroblast-samkulturer ger en modell för att studera in vivo-stamcellsnischen. Här beskrivs ett protokoll för esofageal organoid-fibroblast samkulturer. Dessutom används helmonteringsavbildning för att visualisera fibroblast-organoidinteraktionen.
Epitelstam- och stamceller bidrar till bildandet och underhållet av epitelbarriären under hela livet. De flesta stam- och stamcellspopulationer är undangömda på anatomiskt distinkta platser, vilket möjliggör exklusiva interaktioner med nischsignaler som upprätthåller stamhet. Medan utvecklingen av epiteliala organoidkulturer ger ett kraftfullt verktyg för att förstå stam- och stamcellernas roll i homeostas och sjukdom, är interaktionen inom nischmiljön i stort sett frånvarande, vilket hindrar identifieringen av faktorer som påverkar stamcellsbeteende. Fibroblaster spelar en nyckelroll för att styra epitelstammen och stamfaderns öde. Här presenteras ett omfattande organoid-fibroblast samodlingsprotokoll som möjliggör avgränsning av fibroblastsubpopulationer i esofageal stamcellsförnyelse och differentiering. I detta protokoll beskrivs en metod för att isolera både epitelceller och fibroblaster parallellt från matstrupen. Distinkta fluorescensaktiverade cellsorteringsstrategier för att isolera både matstrupen stamceller såväl som fibroblastsubpopulationerna från antingen transgena reporter eller vildtypsmöss beskrivs. Detta protokoll ger ett mångsidigt tillvägagångssätt som kan anpassas för att tillgodose isoleringen av specifika fibroblastsubpopulationer. Etablering och passage av esofageal epitelial organoid monokultur ingår i detta protokoll, vilket möjliggör en direkt jämförelse med samodlingssystemet. Dessutom beskrivs en 3D-röjningsmetod som möjliggör detaljerad bildanalys av epitelial-fibroblastinteraktioner. Sammantaget beskriver detta protokoll en jämförande och relativt hög genomströmningsmetod för att identifiera och förstå esofageala stamcellsnischkomponenter in vitro.
Organoider används som 3D in vitro-analyser för att karakterisera stam- och stamceller, samt för att förstå signalsignalerna härledda från de cellulära komponenterna i stamcellsnischen 1,2,3,4. Musesofageala organoider beskrevs först 2014 och flera artiklar har identifierat tillväxtfaktorer, som R-Spondin (RSPO), NOGGIN och epidermal tillväxtfaktor (EGF), som behövs för att upprätthålla och passera esofageala organoider 5,6,7, och hävdar att liknande signalsignaler krävs för in vivo förnyelse av stamceller. Tillväxtfaktorer tillsätts emellertid vanligen i icke-fysiologiska koncentrationer, vilket resulterar i organoida tillväxtförhållanden som inte nödvändigtvis återspeglar signalmiljön in vivo.
Fibroblaster är heterogena stromacellspopulationer som stöder stamcellsegenskaper i många stamcellsnischer8. Genom att kombinera epiteliala stamceller och fibroblaster i samma organoidkultur möjliggörs organoidbildning i reducerade koncentrationer av exogent kompletterade tillväxtfaktorer. Organoida samodlingssystem från tarm- och leverepitel beskrivs, men ett protokoll för att upprätta esofageala organoid-fibroblast-samkulturer är fortfarande enastående 9,10,11.
I detta protokoll beskrivs två fluorescensaktiverade cellsorteringsstrategier (FACS) för fibroblaster från matstrupen, med användning av antingen transgena PdgfrαH2BeGFP-möss 12 eller vildtypsmöss med klassisk antikroppsfärgning. Olika subpopulationer av fibroblaster kan isoleras med hjälp av valda cellytmarkörer, vilket ger protokollet flexibilitet. Dessutom används en 3D-fluorescensavbildningsteknik som bevarar organoidmorfologi för att karakterisera fibroblast-organoidinteraktioner. Organoidröjning ger en snabb metod för att öka ljuspenetrationsdjupet i organoiderna, vilket förbättrar visualiseringen av organoid-fibroblastanslutningar och möjliggör rekapitulation av organoidstrukturen i sin helhet. Detta protokoll kombinerar esofageal organoid samkultur med en hel monteringsbildningsstrategi, vilket möjliggör funktionell karakterisering av fibroblast-organoidinteraktionen.
Protokollet som presenteras här etablerar en in vitro-modell för att undersöka funktionella esofageala epitelial-fibroblastinteraktioner.
Epitelskiktet separeras från stroma, vilket möjliggör ett optimerat dissociationsprotokoll för både epitel- och stromalfacket. Trots optimering av epiteldissociationsprotokollet förblir vävnadsklumpar uppenbara. Pipettering upp och ner kraftigt var 15: e minut minskar antalet och storleken på klumpar avsevärt. Andra protokoll använder trypsin för att ytterligare dissociera epitelskiktet 5,6. Här rekommenderas inte användning av trypsin, eller ökning av dissociationstiden ytterligare, eftersom detta tenderar att resultera i minskad epitelcellviabilitet och organoidbildande effektivitet. I motsats till epitelet dissocieras stroma lätt och 30 min i dissociationslösning resulterar i en encellssuspension med ~ 90% fibroblastlivskraft (figur 1E). Att utesluta separationssteget epitel-stomal i protokollet ökar dissociationstiden avsevärt, vilket resulterar i en minskad fibroblastviabilitet och ett lägre utbyte av epitelceller. Dessutom ger separering av epitelet från stroma en möjlighet att bestämma cellnummer för varje population och blanda epitelceller och fibroblaster från olika muslinjer när man ställer in samkulturerna.
Att studera fibroblastfunktion på organoidtillväxt är en vanlig metod inom stamcellsbiologi 9,10,11,15,16. Etablerade samodlingsmedier kompletteras antingen med DMEM kompletterat med 10% fosterkalvserum (FCS)9,15 eller tillväxtfaktorreducerat medium10,16. I detta protokoll används det tillväxtfaktorreducerade mediet för att efterlikna förhållandena i stamcellsnischen in vivo, där fibroblaster i stort sett är vilande. FCS är ett tillväxtfaktorrikt serum som resulterar i aktivering och proliferation av fibroblaster i samkulturerna, vilket sannolikt motsvarar ett fibroblastcelltillstånd som skiljer sig från in vivo-tillståndet. Genom att utesluta FCS och minska tillväxtfaktorerna, så att mediet ensamt (ERlågt) inte stöder organoidtillväxt och inte stimulerar fibroblastproliferation, är det möjligt att isolera fibroblasternas effekt på organoidtillväxten. I detta medium avlägsnas NOGGIN och RSPO reduceras till ett minimum (10% RPSO). Både NOGGIN och RSPO har visat sig vara väsentliga för esofageal organoidtillväxt6. EGF behölls i samodlingsmediet, eftersom det inte stöder organoidtillväxt i sig. Fibroblaster kan emellertid också stödja organoidtillväxt i ett EGF-reducerat medium (E low Rlow; Figur 2B,D).
Organoida samkulturer kan inte upprätthållas genom passaging eftersom fibroblaster förloras under trypsinisering. Organoid passaging inkluderades emellertid i protokollet eftersom esofageala organoider kan bibehållas, expanderas och användas för ytterligare experiment som monokulturer. Passaged organoider från monokulturer kan användas för att skapa samkulturer med nyligen isolerade fibroblaster. En nackdel med att använda primära celler är antalet möss som behövs för att skapa flera organoida samkulturer. När man fokuserar på små subpopulationer av fibroblaster är antalet erhållna samkulturer begränsat. I andra protokoll expanderas fibroblaster först i kultur innan de används för att skapa organoida samkulturer10. Fibroblaster ändrar dock morfologi och identitet under passaging, vilket visas genom att använda primära hud- och hjärtfibroblaster17,18. Konventionell 2D-passaging av esofageal fibroblaster resulterar i både morfologi- och fenotypförändringar, vilket visar att di vitro-anrikning av fibroblaster inte är lämplig för samkulturer som syftar till att fenokopiera den endogena stamcellsnischen.
Färgning av hela berget ger ett verktyg för att upprätthålla och visualisera fibroblast-organoidinteraktion. Det bör noteras att även om inte alla organoider kommer att ha fibroblaster direkt fästa vid dem, är de flesta organoider i kontakt med fibroblaster (se figur 2C). För att upprätthålla epitelial-fibroblastinteraktioner är det viktigt att hantera organoiderna med försiktighet och undvika kraftig pipettering, virvelning och höghastighetsspinning. Optimal fixering är viktig för att upprätthålla 3D-vävnadsarkitektur, samt behålla endogen fluorescens. En 30 minuters fixering räcker för att behålla H2BeGFP-signalen och är optimal för antikropparna som används i detta protokoll, men detta kan variera mellan fluoroforerna och antikropparna som används. Rensning av organoiderna minskar ljusspridningen och förbättrar visualiseringen av hela 3D-strukturen avsevärt. Eftersom organoiderna är små är rensningen enkel och snabb; Att avbilda hela organoider med hjälp av laserskanningskonfokalmikroskopi kan dock vara tidskrävande, eftersom flera Z-staplar måste göras. Konfokalmikroskop, som den snurrande skivan, kan användas för att minska bildtiden.
Sammantaget ger esofageala organoider odlade i närvaro av fibroblaster ett värdefullt verktyg för att förstå aspekter av matstrupen stamcellsnisch. Dessutom ger helmonterad röjning en tillgänglig metod för att visualisera interaktionen mellan fibroblaster och organoider.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av ERC StG TroyCAN (851241). E.E. är postdoktor vid Cancerfonden. M.G. är Ragnar Söderberg Fellow och Cancerfonden Junior Investigator. Vi är tacksamma för det tekniska biståndet från Karolinska Institutets core faciliteter, inklusive Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) och Comparative Medicine Biomedicum (KMB) djuranläggning. Vi tackar medlemmarna i Genander-labbet för att noggrant ha läst och kommenterat protokollet.
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
Plastic & Glassware | |||
Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
Tools | |||
0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
Instruments | |||
Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
Conjugated Antibodies for FACS | |||
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
Antibodies for Immunofluorescence | |||
CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
Secondary antibodies | |||
Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |