Herstellung eines modifizierten autologen konditionierten Serums und ex vivo Beurteilung des Heilungspotentials im murinen Hornhautepithel

Summary

In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um den Prozess zu vereinfachen und die Herstellung von autologem konditioniertem Serum (ACS) kostengünstiger zu machen. Es werden keine speziellen Spritzen oder oberflächenbeschichteten Glasperlen benötigt. Darüber hinaus hat das modifizierte ACS (mACS) bei der Hornhautwundheilung von murinen Augen ex vivo Wettbewerbsvorteile gegenüber herkömmlichem autologem Serum.

Abstract

Topische Therapien aus menschlichem Blut waren in den letzten Jahrzehnten ein Segen für Kliniker. Autologes Serum (AS) und plättchenreiches Plasma (PRP) sind mit epitheliotropen Wachstumsfaktoren angereichert, die für die Wundheilung der Hornhaut unerlässlich sind. Im Gegensatz zu AS basiert PRP auf einem differentiellen Zentrifugationssystem, das mehr Wachstumsfaktoren aus Thrombozyten liefert. Autologes konditioniertes Serum (ACS) konserviert nicht nur die Herstellung von AS und PRP, sondern konzentriert sich auch auf immunmodulierende Eigenschaften, die bei entzündlichen Erkrankungen wichtig sind.

Das Fehlen standardisierter Protokolle und hohe Präparationskosten sind Einschränkungen für die klinische Anwendung von ACS. Dieses Videoexperiment demonstriert ein Standardverfahren zur Herstellung von modifizierten autologen konditionierten Serums (mACS) Augentropfen. Zunächst wurde Glycerin als Stabilisator der Blutzellen während der hypoxischen Inkubation in Heparinspritzen gegeben. Um die Blutzellen zu aktivieren, wurde eine 4-stündige Inkubation bei 37 °C eingeleitet. Anschließend wurden die Blutproben bei 3.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Filtration des Überstandes durch einen 0,22 μm Filter waren die mACS-Augentropfen vollständig aufbereitet.

Eine vorläufige Erprobung der therapeutischen Wirkung von mACS zeigte, dass es bei der Wundheilung der Hornhaut in ex vivo Mäuseaugen Wettbewerbsvorteile gegenüber konventionellem AS haben könnte. Das in dieser Studie verwendete AS wurde nach veröffentlichten Studien und der klinischen Praxis in unserem Krankenhaus erstellt. Daher könnte die Wirksamkeit von mACS bei Erkrankungen der Augenoberfläche in zukünftigen Forschungen durch in vivo Tierstudien und klinische Studien evaluiert werden.

Introduction

Die therapeutische Wirkung von autologem Serum (AS) bei Erkrankungen des trockenen Auges wurde erstmals in den 1980er Jahren von Fox et ^al.1 beschrieben. Es wird angenommen, dass sowohl die schmierende Eigenschaft als auch die essentiellen epitheliotropen biochemischen Komponenten in AS, die natürliche Tränen nachahmen, die Proliferation von Hornhautepithelzellen begünstigen. Auf dieser Grundlage wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Studien durchgeführt. Zu den trophischen Komponenten gehören der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), Vitamin A, der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) und andere Zytokine. Interessanterweise ist das Serum reich an TGF-β und Vitamin A, von denen angenommen wird, dass sie eine zentrale Rolle bei der epidermalen Proliferation spielen 2,3,4,5. Darüber hinaus haben mehrere Studien bei der Behandlung von Patienten mit Erkrankungen der Augenoberfläche einige Vorteile von AS-Augentropfen in Bezug auf die von den Patienten berichteten Ergebnisse, andere objektive Parameter des trockenen Auges ^6,7 und mikroskopische Befunde wie die Zelldichte⁸ gezeigt. Metaanalysestudien zeigten, dass es einige Vorteile bei der Verbesserung der Patientensyndrome durch die Behandlung mit AS-Augentropfen geben könnte, aber es fehlen noch Langzeitergebnisse und Beobachtungen ^9,10.

Im Gegensatz zu AS wird plättchenreiches Plasma (PRP) durch Zugabe eines Antikoagulans während der Präparation mit weiterer differentieller Zentrifugation und chemischer Aktivierung der Blutplättchen gewonnen. Im Vergleich zu AS sind in PRP zahlreiche Chemikalien und Wachstumsfaktoren wie TGF-β, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) und EGF enthalten. Es wurde auch bei Erkrankungen der Augenoberfläche mit klinischem Nutzen bei der Linderung von Symptomen angewendet¹¹.

Die Querverknüpfung zwischen Epitheldefekten und Entzündungen ist komplex. Insbesondere die Immunpathophysiologie ist ein weiteres wichtiges Thema bei Erkrankungen der Augenoberfläche. Es wird angenommen, dass proinflammatorische Zytokine wie IL-1β und IFN-γ zentrale Mediatoren in Entzündungskaskaden sind¹². Auf diese Weise eröffnen sich neue Behandlungswege, die auf dem Verständnis des Immunmechanismus basieren. Strategien zur Stoppung dieses Entzündungsprozesses, einschließlich der Produktion von Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1Ra) und anderen entzündungshemmenden Zytokinen, könnten auch bei Erkrankungen der Augenoberfläche eine wichtige Rolle spielen^13,14,15.

Seit 1998 wird Orthokin, ein kommerzialisiertes autologes konditioniertes Serum (ACS), klinisch bei orthopädischen Patienten eingesetzt, die an Arthrose (OA), rheumatoider Arthritis (RA) und Wirbelsäulenerkrankungen leiden¹³. Im Vergleich zu AS und PRP sind die Behandlung mit chemisch beschichteten Glasperlen und die hypoxische Inkubation zur Aktivierung von Monozyten die Besonderheiten von ACS¹⁶. Theoretisch können mehr entzündungshemmende Faktoren ausgeschüttet werden, indem den Zellen Überlebensstress hinzugefügt wird, was zu einer höheren Konzentration essentieller immunmodulierender Komponenten, einschließlich IL-1Ra, führt. Der verbesserte therapeutische Nutzen von ACS bei Arthrose im Vergleich zu AS wurde ebenfalls berichtet¹⁷. Erkrankungen der Augenoberfläche haben in mancher Hinsicht einen ähnlichen Immunhintergrund wie orthopädische Entzündungserkrankungen. Aufgrund der erfolgreichen Ergebnisse der Therapie mit menschlichem Blut im orthopädischen Bereich könnte ACS daher Vorteile gegenüber konventionellen Behandlungen in der klinischen Praxis durch epitheliotrope und immunmodulierende Eigenschaften haben. Obwohl ACS bei orthopädisch-entzündlichen Erkrankungen weit verbreitet ist, müssen seine klinischen Anwendungen in der Augenheilkunde noch erforscht werden, was durch die hohen Kosten, die mangelnde Literaturunterstützung und die mangelnde Standardisierung des Präparationsprozesses behindert werden kann, was zu unterschiedlichen Leistungen führt.

In diesem Videoartikel wurde eine neuartige, kostengünstige und bequeme Methode zur Erzeugung des modifizierten ACS (mACS) oder wachstumsfaktorreichen Plasmas (PRGF) demonstriert, wodurch eine Augentropfenlösung mit einem vergleichbaren praktischen Wert wie kommerzialisierte ACS hergestellt wird. Die Schlüsselideen, Antikoagulanzien hinzuzufügen und die Blutzellen durch Stressinkubation zur Sekretion von entzündungshemmenden Zytokinen anzuregen, wurden beibehalten, aber im Gegensatz zu den chemisch induzierten Methoden, wie z. B. solchen, die auf CrSO 4-beschichteten Glasperlen und kommerziellen Kits basieren, wird der kritische Stressstatus bei dieser Methode physikalisch durch hypoxische Inkubation induziert. Darüber hinaus wurde Glycerin hinzugefügt, um zusätzliche Vorteile zu bieten, darunter eine Erhöhung der Stabilität der Membran der Blutzellen, die Aufrechterhaltung eines angemessenen osmotischen extrazellulären Flüssigkeitsdrucks¹⁸ und eine geeignete Nährstoffquelle unter hypoxischen Bedingungen, die eine Überlastung der Zellen vermeiden.

Protocol

Die Recherche wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien zu Beginn des Protokollabschnitts durchgeführt. Alle Protokolle und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Institutional Review Board der Chang Gung Medical Foundation geprüft und genehmigt. Alle Probanden wurden über die Art dieser Studie informiert und unterschrieben vor der Aufnahme eine Einverständniserklärung. Die für den gesamten Versuchsablauf benötigten Verbrauchsmaterialien sin…

Representative Results

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die für das Experiment benötigten Materialien, und Abbildung 3 zeigt die aufeinanderfolgenden Schritte und die erfolgreichen Zwischenprodukte während der Herstellung von mACS. Zunächst wurden 0,5 ml 10%ige Glycerinlösung in jedes sterile 10-ml-Reagenzglas gegeben (Abbildung 3A). Dann wurden dem Patienten 60-70 ml venöses Blut entnommen und 10 ml Blut in jedes Rö…

Discussion

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Herstellung von mACS beschrieben und der Nutzen von mACS-Augentropfen bei der Wundheilung von Tiermodellen weiter aufgezeigt. Die entscheidende Modifikation dieses mACS-Protokolls ist die Zugabe von ca. 0,5 ml 10%iger Glycerinlösung in jedes Reagenzglas, wodurch während der 4-stündigen Inkubation bei 37 °C geeignete hypoxische Bedingungen geschaffen werden. Diese Einstellung versorgt den AS mit angemessenem Stress und veranlasst die Zellen, die notwendigen Wachstumsfaktoren ab…

Materials

96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004