إنتاج مصل مكيف ذاتي معدل وتقييم خارج الجسم الحي لإمكاناته العلاجية في ظهارة قرنية الفئران
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولا لتبسيط العملية وجعل تحضير المصل المشروط الذاتي (ACS) أقل تكلفة. ليست هناك حاجة إلى محاقن خاصة أو خرز زجاجي مطلي بالسطح. علاوة على ذلك ، فإن ACS المعدل (mACS) له مزايا تنافسية على المصل الذاتي التقليدي في التئام جروح القرنية لعيون الفئران خارج الجسم الحي.
Abstract
كانت العلاجات الموضعية المشتقة من الدم البشري نعمة للأطباء في العقود الأخيرة. يتم إثراء المصل الذاتي (AS) والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) بعوامل النمو الظهارية الضرورية في التئام جروح القرنية. على عكس AS ، يعتمد PRP على نظام الطرد المركزي التفاضلي ، مما ينتج عنه المزيد من عوامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية. المصل المكيف الذاتي (ACS) لا يحافظ فقط على إعداد AS و PRP ، ولكنه يركز أيضا على خصائص تعديل المناعة ، والتي تعتبر مهمة في الأمراض الالتهابية.
يعد الافتقار إلى البروتوكولات الموحدة وتكاليف التحضير المرتفعة قيودا على التطبيق السريري ل ACS. توضح تجربة الفيديو هذه إجراء تشغيليا قياسيا لتحضير قطرات العين المعدلة ذات المصل الذاتي المكيف (mACS). أولا ، تمت إضافة الجلسرين إلى محاقن الهيبارين كمثبت لخلايا الدم أثناء حضانة نقص الأكسجين. لتنشيط خلايا الدم ، بدأت حضانة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم طرد عينات الدم بالطرد المركزي عند 3500 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ترشيح المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، تم تحضير قطرات العين mACS بالكامل.
أظهرت تجربة مبدئية للتأثير العلاجي ل mACS أنه قد يكون له مزايا تنافسية على AS التقليدي في التئام جروح القرنية في عيون الفئران خارج الجسم الحي. تم إعداد AS المستخدم في هذه الدراسة وفقا للدراسات المنشورة والممارسة السريرية في مستشفانا. لذلك ، يمكن تقييم فعالية mACS على أمراض سطح العين في الأبحاث المستقبلية من خلال الدراسات الحيوانية في الجسم الحي والتجارب السريرية.
Introduction
تم الإبلاغ عن الآثار العلاجية للمصل الذاتي (AS) في أمراض جفاف العين لأول مرة في ثمانينيات القرن العشرين من قبل Fox et al.1. ويعتقد أن كل من خاصية التشحيم والمكونات الكيميائية الحيوية الأساسية الظهارية في AS، التي تحاكي الدموع الطبيعية، تفيد تكاثر الخلايا الظهارية القرنية. على مدى العقود الماضية ، تم إجراء العديد من الدراسات على هذا الأساس. تشمل المكونات الغذائية عامل نمو البشرة (EGF) وفيتامين أ وعامل النمو المحول β (TGF- β) والسيتوكينات الأخرى. ومن المثير للاهتمام أن المصل غني ب TGF- β وفيتامين أ ، والتي يعتقد أنها تلعب دورا محوريا في تكاثر البشرة2،3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، عند علاج المرضى الذين يعانون من أمراض سطح العين ، أظهرت العديد من الدراسات بعض مزايا قطرات العين AS في النتائج التي أبلغ عنها المريض ، ومعلمات العين الجافة الموضوعيةالأخرى 6,7 ، والنتائج المجهرية مثل كثافة الخلايا8. كشفت دراسات التحليل التلوي أنه قد تكون هناك بعض الفوائد في تحسين متلازمات المريض مع علاج قطرات العين AS ، ولكن النتائج والملاحظات على المدى الطويل لا تزال تفتقر إلى 9,10.
على عكس AS ، يتم اشتقاق البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) من إضافة مضاد للتخثر أثناء التحضير ، مع مزيد من الطرد المركزي التفاضلي والتنشيط الكيميائي للصفائح الدموية. بالمقارنة مع AS ، توجد العديد من المواد الكيميائية وعوامل النمو ، مثل TGF- β ، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، و EGF ، في PRP. كما تم تطبيقه على أمراض سطح العين مع فوائد سريرية في تخفيف الأعراض11.
العلاقة المتقاطعة بين العيوب الظهارية والالتهاب معقدة. والجدير بالذكر أن الفيزيولوجيا المناعية هي قضية مهمة أخرى في أمراض سطح العين. يعتقد أن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مثل IL-1β و IFN-γ ، هي وسطاء محوريون في الشلالات الالتهابية12. وبالتالي يتم فتح طرق جديدة للعلاج على أساس فهم آلية المناعة. قد تلعب استراتيجيات إيقاف هذه العملية الالتهابية ، بما في ذلك إنتاج مضادات مستقبلات الإنترلوكين -1 (IL-1Ra) وغيرها من السيتوكينات المضادة للالتهابات ، دورا مهما في أمراض سطح العين13،14،15.
منذ عام 1998 ، تم استخدام Orthokine ، وهو مصل مكيف ذاتي تجاري (ACS) ، سريريا في مرضى العظام الذين يعانون من هشاشة العظام (OA) والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA) واضطرابات العمود الفقري13. بالمقارنة مع AS و PRP ، فإن العلاج بالخرز الزجاجي المطلي كيميائيا وحضانة نقص الأكسجين لتنشيط الخلايا الوحيدة هي السمات المحددة ل ACS16. من الناحية النظرية ، يمكن إفراز المزيد من العوامل المضادة للالتهابات عن طريق إضافة إجهاد البقاء على قيد الحياة إلى الخلايا ، مما يؤدي إلى تركيز أعلى من المكونات الأساسية المعدلة للمناعة ، بما في ذلك IL-1Ra. كما تم الإبلاغ عن الفوائد العلاجية المحسنة ل ACS في الزراعة العضوية ، مقارنة ب AS ،17. تشترك أمراض سطح العين في خلفيات مناعية مماثلة مع أمراض التهاب العظام في بعض النواحي. لذلك ، بناء على النتائج الناجحة للعلاج المشتق من الدم البشري في مجال تقويم العظام ، قد يكون ل ACS مزايا على العلاجات التقليدية في الممارسة السريرية من خلال خصائص الظهارة وتعديل المناعة. على الرغم من استخدام ACS على نطاق واسع في أمراض التهاب العظام ، إلا أن تطبيقاته السريرية في طب العيون لا تزال بحاجة إلى استكشاف ، والتي قد تعوقها تكلفتها العالية ، ونقص دعم الأدبيات ، وعدم توحيد عملية التحضير ، مما يؤدي إلى أداء متنوع.
في مقالة الفيديو هذه ، تم عرض طريقة جديدة وفعالة من حيث التكلفة ومريحة لتوليد ACS المعدل (mACS) ، أو البلازما الغنية بعوامل النمو (PRGF) ، مما ينتج عنه محلول قطرة العين بقيمة عملية مماثلة ل ACSs التجارية. تم الاحتفاظ بالأفكار الرئيسية لإضافة مضادات التخثر وتحفيز خلايا الدم على إفراز السيتوكينات المضادة للالتهابات عن طريق الحضانة المجهدة ، ولكن على عكس الطرق المستحثة كيميائيا ، مثل تلك القائمة على الخرز الزجاجي المطلي ب CrSO4 والمجموعات التجارية ، يتم تحفيز حالة الإجهاد الحرجة جسديا عن طريق حضانة نقص الأكسجين في هذه الطريقة. علاوة على ذلك ، تمت إضافة الجلسرين لتوفير فوائد إضافية ، بما في ذلك زيادة استقرار غشاء خلايا الدم ، والحفاظ على ضغط السائل خارج الخلية التناضحيالمناسب 18 ، ومصدر مناسب للمغذيات في حالات نقص الأكسجين التي تتجنب الإجهاد الزائد للخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول لإعداد mACS وتظهر فائدة قطرات العين mACS في التئام الجروح للنماذج الحيوانية. التعديل الحاسم لبروتوكول mACS هذا هو إضافة ما يقرب من 0.5 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ في كل أنبوب اختبار ، مما يخلق ظروفا مناسبة لنقص الأكسجين خلال فترة الحضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون Ya-Lan Chien و Chia-Ying Lee على المساعدة الفنية الممتازة ، وشركة OnLine English على الطبعة اللغوية. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مشروع تشانغ غونغ للبحوث الطبية (رقم المنحة CMRPG3L1491).
Materials
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
Riferimenti
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren’s syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O’Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
