Productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol om het proces te vereenvoudigen en de bereiding van autoloog geconditioneerd serum (ACS) goedkoper te maken. Er zijn geen speciale spuiten of glasparels met een oppervlaktecoating nodig. Bovendien heeft het gemodificeerde ACS (mACS) concurrentievoordelen ten opzichte van conventioneel autoloog serum in de hoornvlieswondgenezing van muriene ogen ex vivo.

Abstract

Van menselijk bloed afgeleide topische therapieën zijn de afgelopen decennia een zegen geweest voor clinici. Autoloog serum (AS) en bloedplaatjesrijk plasma (PRP) zijn verrijkt met epitheliotrope groeifactoren die essentieel zijn bij de genezing van hoornvlieswonden. In tegenstelling tot AS is PRP gebaseerd op een differentieel centrifugatiesysteem, wat meer van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren oplevert. Autoloog geconditioneerd serum (ACS) behoudt niet alleen de bereiding van AS en PRP, maar richt zich ook op immuunmodulerende eigenschappen, die belangrijk zijn bij ontstekingsziekten.

Het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen en hoge voorbereidingskosten zijn beperkingen voor de klinische toepassing van ACS. Dit video-experiment demonstreert een standaard werkwijze voor het bereiden van gemodificeerde autologe geconditioneerde serum (mACS) oogdruppels. Eerst werd glycerol toegevoegd aan heparinespuiten als de bloedcelstabilisator tijdens hypoxische incubatie. Om de bloedcellen te activeren, werd een incubatie van 4 uur bij 37 °C gestart. Vervolgens werden de bloedmonsters gecentrifugeerd bij 3.500 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na filtratie van het supernatant door een filter van 0,22 μm werden de mACS-oogdruppels volledig voorbereid.

Een voorzichtige try-out van het therapeutische effect van mACS toonde aan dat het concurrentievoordelen kan hebben ten opzichte van conventionele AS in de hoornvlieswondgenezing in ex vivo muizenogen. De AS die in deze studie werd gebruikt, werd opgesteld volgens gepubliceerde studies en de klinische praktijk in ons ziekenhuis. Daarom kan de werkzaamheid van mACS op oculaire oppervlakteziekten in toekomstig onderzoek worden geëvalueerd door middel van in vivo dierstudies en klinische proeven.

Introduction

De therapeutische effecten van autoloog serum (AS) bij droge ogen werden voor het eerst gemeld in de jaren 1980 door Fox et ^al.1. Er wordt aangenomen dat zowel de smerende eigenschap als de essentiële epitheliotrope biochemische componenten in AS, die natuurlijke tranen nabootsen, de proliferatie van cornea-epitheelcellen ten goede komen. In de afgelopen decennia zijn op basis hiervan verschillende onderzoeken uitgevoerd. Trofische componenten omvatten epidermale groeifactor (EGF), vitamine A, transformerende groeifactor β (TGF-β) en andere cytokines. Interessant is dat het serum rijk is aan TGF-β en vitamine A, waarvan wordt aangenomen dat ze een cruciale rol spelen bij epidermale proliferatie 2,3,4,5. Bovendien hebben verschillende studies bij de behandeling van patiënten met oculaire oppervlakteziekten enkele voordelen van AS-oogdruppels aangetoond in door de patiënt gerapporteerde uitkomsten, andere objectieve droge ogenparameters ^6,7 en microscopische bevindingen zoals celdichtheid⁸. Meta-analyse studies toonden aan dat er enkele voordelen kunnen zijn bij het verbeteren van de syndromen van patiënten met AS-oogdruppelbehandeling, maar langetermijnresultaten en observaties ontbreken nog steeds ^9,10.

In tegenstelling tot AS wordt bloedplaatjesrijk plasma (PRP) afgeleid van het toevoegen van een antistollingsmiddel tijdens de bereiding, met verdere differentiële centrifugatie en chemische activering van de bloedplaatjes. In vergelijking met AS zijn tal van chemicaliën en groeifactoren, zoals TGF-β, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en EGF, aanwezig in PRP. Het is ook toegepast op oculaire oppervlakteziekten met klinische voordelen bij symptoomverlichting¹¹.

Het verband tussen epitheeldefecten en ontsteking is complex. Met name immunopathofysiologie is een ander belangrijk probleem bij oculaire oppervlakteziekten. Pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1β en IFN-γ, worden verondersteld cruciale mediatoren te zijn in inflammatoire cascades¹². Nieuwe wegen van behandeling worden dus geopend op basis van het begrijpen van het immuunmechanisme. Strategieën om dit ontstekingsproces te stoppen, waaronder de productie van interleukine-1 receptorantagonist (IL-1Ra) en andere ontstekingsremmende cytokines, kunnen ook een belangrijke rol spelen bij oculaire oppervlakteziekten^13,14,15.

Sinds 1998 wordt Orthokine, een gecommercialiseerd autoloog geconditioneerd serum (ACS), klinisch gebruikt bij orthopedische patiënten die lijden aan artrose (OA), reumatoïde artritis (RA) en spinale aandoeningen¹³. In vergelijking met AS en PRP zijn behandeling met chemisch gecoate glasparels en hypoxische incubatie om monocyten te activeren de specifieke kenmerken van ACS¹⁶. Theoretisch kunnen meer ontstekingsremmende factoren worden uitgescheiden door overlevingsstress aan de cellen toe te voegen, wat resulteert in een hogere concentratie van essentiële immuunmodulerende componenten, waaronder IL-1Ra. De verbeterde therapeutische voordelen van ACS bij artrose, vergeleken met AS, zijn ook gemeld¹⁷. Oculaire oppervlakteziekten delen in sommige opzichten vergelijkbare immuunachtergronden met orthopedische ontstekingsziekten. Daarom, op basis van de succesvolle resultaten van van menselijk bloed afgeleide therapie op orthopedisch gebied, kan ACS voordelen hebben ten opzichte van conventionele behandelingen in de klinische praktijk door epitheliotrope en immuunmodulerende eigenschappen. Hoewel ACS op grote schaal is gebruikt bij orthopedische ontstekingsziekten, moeten de klinische toepassingen in de oogheelkunde nog worden onderzocht, wat kan worden belemmerd door de hoge kosten, het gebrek aan literatuurondersteuning en het gebrek aan standaardisatie van het voorbereidingsproces, wat resulteert in diverse prestaties.

In dit videoartikel werd een nieuwe, kosteneffectieve en handige methode gedemonstreerd om de gemodificeerde ACS (mACS) of plasma rijk aan groeifactoren (PRGF) te genereren, waardoor een oogdruppeloplossing ontstaat met een vergelijkbare praktische waarde als gecommercialiseerde ACS’en. De belangrijkste ideeën over het toevoegen van anticoagulantia en het triggeren van de bloedcellen om ontstekingsremmende cytokines af te scheiden door gestreste incubatie werden behouden, maar in tegenstelling tot de chemisch geïnduceerde methoden, zoals die op basis van CrSO 4-gecoate glasparels en commerciële kits, wordt de kritieke stressstatus fysiek geïnduceerd door hypoxische incubatie in deze methode. Bovendien werd glycerol toegevoegd om extra voordelen te bieden, waaronder een toename van de stabiliteit van het membraan van bloedcellen, behoud van een goede osmotische extracellulaire vloeistofdruk¹⁸ en een geschikte bron van voedingsstoffen in hypoxische omstandigheden die overbelasting van de cellen voorkomen.

Protocol

Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen aan het begin van het protocolgedeelte. Alle protocollen en procedures werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en werden beoordeeld en goedgekeurd door de Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle vrijwilligers werden geïnformeerd over de aard van deze studie en ondertekenden een geïnformeerd toestemmingsformulier voorafgaand aan hun opname. De verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gehele experimentele…

Representative Results

Figuur 1 en figuur 2 tonen de materialen die nodig zijn voor het experiment en figuur 3 toont de opeenvolgende stappen en de succesvolle tussenproducten tijdens de bereiding van mACS. Eerst werd 0,5 ml 10% glyceroloplossing toegevoegd aan elke steriele reageerbuis van 10 ml (figuur 3A). Vervolgens werd 60-70 ml veneus bloed van de patiënt verkregen en 10 ml bloed in elke buis geïnjecteerd (<strong cla…

Discussion

In deze studie wordt een protocol voor de bereiding van mACS beschreven en wordt het voordeel van mACS oogdruppels bij de wondgenezing van diermodellen verder aangetoond. De cruciale wijziging van dit mACS-protocol is de toevoeging van ongeveer 0,5 ml 10% glyceroloplossing in elke reageerbuis, die geschikte hypoxische omstandigheden creëert tijdens de incubatie van 4 uur bij 37 °C. Deze instelling voorziet de AS van de juiste stress en zet cellen ertoe aan om de nodige groeifactoren af te scheiden die de wondgenezing …

Materials

96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004