변형된 자가 조절 혈청의 생산 및 쥐 각막 상피에서의 치유 가능성에 대한 생체 외 평가
Summary
이 기사에서는 공정을 단순화하고 자가 컨디셔닝 세럼(ACS) 준비 비용을 낮추는 프로토콜에 대해 설명합니다. 특별한 주사기 또는 표면 코팅 유리 구슬이 필요하지 않습니다. 더욱이, 변형된 ACS(mACS)는 생체 외에서 쥐 눈의 각막 상처 치유에 있어서 종래의 자가 혈청에 비해 경쟁 우위를 갖는다.
Abstract
인간 혈액 유래 국소 요법은 최근 수십 년 동안 임상의에게 큰 도움이 되었습니다. 자가 혈청(AS)과 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)은 각막 상처 치유에 필수적인 상피친화성 성장 인자를 풍부하게 함유하고 있습니다. AS와 달리 PRP는 차등 원심분리 시스템을 기반으로 하여 더 많은 혈소판 유래 성장 인자를 생성합니다. 자가 컨디셔닝 세럼(ACS)은 AS 및 PRP의 준비를 보존할 뿐만 아니라 염증성 질환에서 중요한 면역 조절 특성에 중점을 둡니다.
표준화된 프로토콜의 부족과 높은 준비 비용은 ACS의 임상 적용에 대한 한계입니다. 이 비디오 실험은 변형된 자가 컨디셔닝 혈청(mACS) 점안액을 준비하기 위한 표준 작동 절차를 보여줍니다. 먼저, 글리세롤은 저산소 배양 동안 혈액 세포 안정제로서 헤파린 주사기에 첨가되었습니다. 혈액 세포를 활성화시키기 위해, 37°C에서 4시간 인큐베이션을 개시하였다. 이어서, 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 3,500 × g 에서 원심분리하였다. 상층액을 0.22 μm 필터를 통해 여과한 후, mACS 점안액을 완전히 제조하였다.
mACS의 치료 효과에 대한 잠정적인 시험은 생체 외 마우스 눈에서 각막 상처 치유에서 기존 AS에 비해 경쟁 우위를 가질 수 있음을 보여주었습니다. 본 연구에 사용된 AS는 발표된 연구와 본원의 임상 실습에 따라 작성되었습니다. 따라서 안구 표면 질환에 대한 mACS의 효능은 in vivo 동물 연구 및 임상 시험을 통해 향후 연구에서 평가될 수 있습니다.
Introduction
안구건조증에서 자가 혈청(AS)의 치료 효과는 1980년대 Fox et al.1에 의해 처음 보고되었습니다. 자연 눈물을 모방한 AS의 윤활 특성과 필수 상피친화성 생화학적 성분 모두 각막 상피 세포의 증식에 도움이 되는 것으로 믿어집니다. 지난 수십 년 동안 여러 연구가 이를 기반으로 수행되었습니다. 영양 성분은 표피 성장 인자 (EGF), 비타민 A, 형질전환 성장 인자 β (TGF-β) 및 다른 사이토카인을 포함한다. 흥미롭게도, 혈청은 TGF-β 및 비타민 A가 풍부하며, 이들은 표피 증식에 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다 2,3,4,5. 또한, 안구 표면 질환 환자를 치료할 때, 여러 연구에서 환자가 보고한 결과, 기타 객관적인 안구건조증수치 6,7 및 세포 밀도와 같은 현미경적 소견에서 AS 점안액의 몇 가지 이점을 보여주었다8. 메타 분석 연구에 따르면 AS 점안액 치료로 환자의 증후군을 개선하는 데 몇 가지 이점이 있을 수 있지만 장기적인 결과와 관찰은 여전히부족합니다 9,10.
AS와 달리 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 준비 중에 항응고제를 첨가하여 파생되며, 혈소판의 추가 차등 원심분리 및 화학적 활성화가 있습니다. AS와 비교하여 TGF-β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 EGF와 같은 수많은 화학 물질 및 성장 인자가 PRP에 존재합니다. 또한 안구 표면 질환에도 적용되어 증상 완화에 임상적 이점이 있다11.
상피 결함과 염증 사이의 교차 결합은 복잡합니다. 특히, 면역병태생리학은 안구 표면 질환의 또 다른 중요한 문제입니다. IL-1β 및 IFN-γ과 같은 전염증성 사이토카인은 염증성 캐스케이드에서 중추적인 매개체인 것으로 여겨진다12. 따라서 면역 메커니즘에 대한 이해를 바탕으로 새로운 치료 방법이 열립니다. 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 및 기타 항염증성 사이토카인의 생산을 포함하여 이러한 염증 과정을 멈추게 하는 전략은 또한 안구 표면 질환에서 중요한 역할을 할 수 있다13,14,15.
1998년부터 상용화된 자가 컨디셔닝 혈청(ACS)인 오르토카인은 골관절염(OA), 류마티스 관절염(RA) 및 척추 질환을 앓고 있는 정형외과 환자에게 임상적으로 사용되어 왔다13. AS 및 PRP와 비교하여 화학적으로 코팅된 유리 비드로 처리하고 단핵구를 활성화하기 위한 저산소 배양은 ACS16의 특정 특징입니다. 이론적으로 세포에 생존 스트레스를 가함으로써 더 많은 항염증 인자를 분비할 수 있으며, 그 결과 IL-1Ra를 포함한 필수 면역 조절 성분의 농도가 높아집니다. AS와 비교하여 OA에서 ACS의 개선된 치료 효과 또한 보고되었다17. 안구 표면 질환은 어떤 면에서 정형외과적 염증성 질환과 유사한 면역 배경을 공유합니다. 따라서 정형외과 분야에서 인간 혈액 유래 치료의 성공적인 결과를 바탕으로 ACS는 상피친화성 및 면역 조절 특성에 의해 임상 실습에서 기존 치료법에 비해 이점을 가질 수 있습니다. ACS는 정형외과 염증성 질환에 널리 사용되어 왔지만 안과에서의 임상 적용은 여전히 탐색이 필요하며, 이는 높은 비용, 문헌 지원 부족, 준비 과정의 표준화 부족으로 인해 방해를 받을 수 있어 다양한 성능을 제공합니다.
이 비디오 기사에서는 변형된 ACS(mACS) 또는 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장을 생성하여 상용화된 ACS에 필적하는 실용적인 가치를 지닌 점안액 용액을 생성하는 새롭고 비용 효율적이며 편리한 방법을 시연했습니다. 항응고제를 첨가하고 스트레스 배양을 통해 혈액 세포가 항염증성 사이토카인을 분비하도록 하는 핵심 아이디어는 유지되었지만 CrSO4 코팅 유리 구슬 및 상업용 키트를 기반으로 하는 방법과 같은 화학적 유도 방법과 달리 이 방법에서는 저산소 배양에 의해 임계 스트레스 상태가 물리적으로 유도됩니다. 또한, 글리세롤은 혈액 세포막의 안정성 증가, 적절한 삼투성 세포외액 압력의 유지(18), 세포에 과도한 스트레스를 주지 않는 저산소 상태에서 적절한 영양소 공급원을 포함하여 추가적인 이점을 제공하기 위해 첨가되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 mACS를 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고 동물 모델의 상처 치유에서 mACS 점안액의 이점을 추가로 보여줍니다. 이 mACS 프로토콜의 중요한 수정은 각 시험관에 약 0.5mL의 10% 글리세롤 용액을 첨가하여 37°C에서 4시간 배양하는 동안 적절한 저산소 조건을 생성하는 것입니다. 이 설정은 AS에 적절한 스트레스를 제공하고 세포가 상처 치유에 도움이 되는 필요한 성장 인자를 분비하도?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 훌륭한 기술 지원을 해준 Ya-Lan Chien과 Chia-Ying Lee, 그리고 언어판에 대해 OnLine English 회사에 감사드립니다. 이 연구는 Chang Gung Medical Research Project(보조금 번호 CMRPG3L1491)에서 부분적으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
Riferimenti
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