Produksjon av modifisert autologt kondisjonert serum og ex vivo vurdering av dets helbredende potensial i musint hornhinneepitel

Summary

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å forenkle prosessen og gjøre fremstillingen av autologt betinget serum (ACS) billigere. Ingen spesielle sprøyter eller overflatebelagte glassperler er nødvendig. Videre har den modifiserte ACS (mACS) konkurransefortrinn i forhold til konvensjonelt autologt serum i hornhinnen sårheling av murine øyne ex vivo.

Abstract

Humane blodavledede topiske terapier har vært en velsignelse for klinikere de siste tiårene. Autologt serum (AS) og blodplaterikt plasma (PRP) er beriket i epiteliotrope vekstfaktorer som er essensielle i sårtilheling av hornhinnen. I motsetning til AS er PRP basert på et differensialsentrifugeringssystem, noe som gir flere blodplateavledede vekstfaktorer. Autologt betinget serum (ACS) bevarer ikke bare preparatet av AS og PRP, men fokuserer også på immunmodulerende egenskaper, som er viktige i inflammatoriske sykdommer.

Mangelen på standardiserte protokoller og høye forberedelseskostnader er begrensninger for den kliniske anvendelsen av ACS. Dette videoeksperimentet demonstrerer en standard operasjonsprosedyre for fremstilling av modifiserte autologe betingede serum (mACS) øyedråper. Først ble glyserol tilsatt heparinsprøyter som blodcellestabilisator under hypoksisk inkubasjon. For å aktivere blodcellene ble det startet en 4 timers inkubasjon ved 37 °C. Deretter ble blodprøvene sentrifugert ved 3 500 × g i 10 min ved romtemperatur. Etter filtrering av supernatanten gjennom et 0,22 μm filter ble mACS øyedråper fullstendig forberedt.

En tentativ utprøving av den terapeutiske effekten av mACS viste at det kan ha konkurransefortrinn i forhold til konvensjonell AS i hornhinnen sårheling i ex vivo museøyne. AS brukt i denne studien er utarbeidet i henhold til publiserte studier og klinisk praksis ved vårt sykehus. Derfor kan effekten av mACS på øyeoverflatesykdommer evalueres i fremtidig forskning gjennom in vivo dyreforsøk og kliniske studier.

Introduction

De terapeutiske effektene av autologt serum (AS) i tørre øyesykdommer ble først rapportert på 1980-tallet av Fox et ^al.1. Det antas at både smøreegenskapen og de essensielle epiteliotrope biokjemiske komponentene i AS, som etterligner naturlige tårer, fordeler spredning av hornhinneepitelceller. I løpet av de siste tiårene har flere studier blitt utført på dette grunnlaget. Trofiske komponenter inkluderer epidermal vekstfaktor (EGF), vitamin A, transformerende vekstfaktor β (TGF-β) og andre cytokiner. Interessant nok er serumet rikt på TGF-β og vitamin A, som antas å spille en sentral rolle i epidermal proliferasjon 2,3,4,5. I tillegg, ved behandling av pasienter med okulære overflatesykdommer, har flere studier vist noen fordeler med AS øyedråper i pasientrapporterte utfall, andre objektive tørre øyeparametere ^6,7 og mikroskopiske funn som celletetthet⁸. Meta-analysestudier viste at det kan være noen fordeler ved å forbedre pasientens syndromer med AS øyedråper behandling, men langsiktige resultater og observasjoner mangler fortsatt ^9,10.

I motsetning til AS er blodplaterikt plasma (PRP) avledet fra tilsetning av et antikoagulant under preparatet, med ytterligere differensialsentrifugering og kjemisk aktivering av blodplatene. Sammenlignet med AS er mange kjemikalier og vekstfaktorer, som TGF- β, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) og EGF, tilstede i PRP. Det har også blitt brukt på okulære overflatesykdommer med kliniske fordeler i symptomlindring¹¹.

Tverrbindingen mellom epiteldefekter og inflammasjon er kompleks. Spesielt er immunpatofysiologi et annet viktig problem i okulære overflatesykdommer. Proinflammatoriske cytokiner, som IL-1β og IFN-γ, antas å være sentrale mediatorer i inflammatoriske kaskader¹². Nye behandlingsveier åpnes dermed basert på forståelse av immunmekanismen. Strategier for å stoppe denne inflammatoriske prosessen, inkludert produksjon av interleukin-1-reseptorantagonist (IL-1Ra) og andre antiinflammatoriske cytokiner, kan også spille en viktig rolle i okulære overflatesykdommer^13,14,15.

Siden 1998 har Orthokine, et kommersialisert autologt betinget serum (ACS), blitt brukt klinisk hos ortopediske pasienter som lider av slitasjegikt (OA), revmatoid artritt (RA) og rygglidelser¹³. Sammenlignet med AS og PRP er behandling med kjemisk belagte glassperler og hypoksisk inkubasjon for å aktivere monocytter de spesifikke egenskapene til ACS¹⁶. Teoretisk sett kan flere antiinflammatoriske faktorer utskilles ved å legge overlevelsesstress til cellene, noe som resulterer i en høyere konsentrasjon av essensielle immunmodulerende komponenter, inkludert IL-1Ra. De forbedrede terapeutiske fordelene med ACS i OA, sammenlignet med AS, har også blitt rapportert¹⁷. Okulære overflatesykdommer deler lignende immunbakgrunn med ortopediske inflammatoriske sykdommer i noen henseender. Derfor, basert på de vellykkede resultatene av human blodavledet terapi i det ortopediske feltet, kan ACS ha fordeler i forhold til konvensjonelle behandlinger i klinisk praksis ved epiteliotrope og immunmodulerende egenskaper. Selv om ACS har blitt mye brukt i ortopediske inflammatoriske sykdommer, må dets kliniske anvendelser i oftalmologi fortsatt utforskes, noe som kan hindres av høye kostnader, mangel på litteraturstøtte og mangel på standardisering av preparatprosessen, noe som resulterer i mangfoldig ytelse.

I denne videoartikkelen ble det vist en ny, kostnadseffektiv og praktisk metode for å generere modifisert ACS (mACS), eller plasma rik på vekstfaktorer (PRGF), som produserer en øyedråpeløsning med en sammenlignbar praktisk verdi for kommersialiserte ACS. Nøkkelideene om å tilsette antikoagulantia og utløse blodcellene til å utskille antiinflammatoriske cytokiner ved stresset inkubasjon ble beholdt, men i motsetning til de kjemisk induserte metodene, som de som er basert på CrSO 4-belagte glassperler og kommersielle sett, blir den kritiske stressstatusen fysisk indusert av hypoksisk inkubasjon i denne metoden. Videre ble glyserol tilsatt for å gi ekstra fordeler, inkludert en økning i stabiliteten til membranen i blodceller, vedlikehold av et riktig osmotisk ekstracellulært væsketrykk¹⁸ og en passende kilde til næringsstoffer under hypoksiske forhold som unngår overbelastning av cellene.

Protocol

Forskningen ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer i begynnelsen av protokolldelen. Alle protokoller og prosedyrer ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen og ble gjennomgått og godkjent av Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle frivillige ble informert om innholdet i denne studien og signerte et informert samtykkeskjema før de ble inkludert. Forbruksvarer som kreves for hele eksperimentell prosedyre er presentert i figur 1 og <strong class=…

Representative Results

Figur 1 og figur 2 viser materialene som trengs for eksperimentet, og figur 3 viser sekvensielle trinn og vellykkede mellomprodukter under fremstilling av mACS. Først ble 0,5 ml 10 % glyseroloppløsning tilsatt i hvert 10 ml sterilt reagensrør (figur 3A). Deretter fikk pasienten 60-70 ml venøst blod, og injiserte 10 ml blod i hvert rør (figur 3B). Pasientens blod må un…

Discussion

I denne studien er en protokoll for fremstilling av mACS beskrevet og fordelen med mACS øyedråper i sårheling av dyremodeller er videre vist. Den avgjørende modifikasjonen av denne mACS-protokollen er tilsetningen av ca. 0,5 ml 10% glyseroloppløsning i hvert reagensrør, noe som skaper passende hypoksiske forhold under 4-timers inkubasjonen ved 37 °C. Denne innstillingen gir AS-et riktig stress og ber cellene om å utskille de nødvendige vekstfaktorene som hjelper sårheling. 0,22 μm filteret kan bidra til å el…

Materials

96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004