Produktion av modifierat autologt konditionerat serum och ex vivo-bedömning av dess läkningspotential i murint hornhinneepitel

Summary

Denna artikel beskriver ett protokoll för att förenkla processen och göra beredningen av autologt konditionerat serum (ACS) billigare. Inga speciella sprutor eller ytbelagda glaspärlor behövs. Dessutom har den modifierade ACS (mACS) konkurrensfördelar jämfört med konventionellt autologt serum vid sårläkning av murina ögon ex vivo.

Abstract

Mänskliga blod-härledda aktuella terapier har varit en välsignelse för kliniker under de senaste decennierna. Autologt serum (AS) och trombocytrik plasma (PRP) är anrikade i epiteliotropa tillväxtfaktorer som är väsentliga vid sårläkning i hornhinnan. Till skillnad från AS är PRP baserat på ett differentiellt centrifugeringssystem, vilket ger fler trombocytbaserade tillväxtfaktorer. Autologt konditionerat serum (ACS) bevarar inte bara beredningen av AS och PRP, utan fokuserar också på immunmodulerande egenskaper, som är viktiga vid inflammatoriska sjukdomar.

Bristen på standardiserade protokoll och höga förberedelsekostnader är begränsningar för klinisk tillämpning av ACS. Detta videoexperiment visar en standardprocedur för beredning av modifierade autologa konditionerade serum (mACS) ögondroppar. Först tillsattes glycerol i heparinsprutor som blodcellsstabilisator under hypoxisk inkubation. För att aktivera blodkropparna initierades en 4 h inkubation vid 37 °C. Därefter centrifugerades blodproverna vid 3 500 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter filtrering av supernatanten genom ett 0,22 μm filter var mACS ögondroppar fullt förberedda.

En tentativ undersökning av den terapeutiska effekten av mACS visade att det kan ha konkurrensfördelar jämfört med konventionell AS vid sårläkning i hornhinnans sår i mus ex vivo . AS som användes i denna studie utarbetades enligt publicerade studier och klinisk praxis på vårt sjukhus. Därför kan effekten av mACS på sjukdomar på ögonytan utvärderas i framtida forskning genom in vivo-djurstudier och kliniska prövningar.

Introduction

De terapeutiska effekterna av autologt serum (AS) vid torra ögonsjukdomar rapporterades först på 1980-talet av Fox et ^al.1. Man tror att både smörjegenskapen och de väsentliga epiteliotropa biokemiska komponenterna i AS, som efterliknar naturliga tårar, gynnar spridningen av hornhinneepitelceller. Under de senaste decennierna har flera studier utförts på grundval av detta. Trofiska komponenter inkluderar epidermal tillväxtfaktor (EGF), vitamin A, transformerande tillväxtfaktor β (TGF-β) och andra cytokiner. Intressant nog är serumet rikt på TGF-β och vitamin A, som tros spela en avgörande roll i epidermal proliferation 2,3,4,5. Vid behandling av patienter med ögonytesjukdomar har dessutom flera studier visat vissa fördelar med AS-ögondroppar i patientrapporterade resultat, andra objektiva parametrar för torra ögon ^6,7 och mikroskopiska fynd såsom celldensitet⁸. Metaanalysstudier visade att det kan finnas vissa fördelar med att förbättra patientens syndrom med AS-ögondroppsbehandling, men långsiktiga resultat och observationer saknas fortfarande ^9,10.

Till skillnad från AS härrör trombocytrik plasma (PRP) från tillsats av ett antikoagulantia under beredningen, med ytterligare differentialcentrifugering och kemisk aktivering av blodplättarna. Jämfört med AS finns många kemikalier och tillväxtfaktorer, såsom TGF-β, vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och EGF, närvarande i PRP. Det har också tillämpats på ögonytesjukdomar med kliniska fördelar vid symtomlindring¹¹.

Tvärbindningen mellan epiteldefekter och inflammation är komplex. I synnerhet är immunopatofysiologi en annan viktig fråga vid ögonytsjukdomar. Proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-1β och IFN-γ, tros vara pivotala mediatorer i inflammatoriska kaskader¹². Nya behandlingsvägar öppnas därmed baserat på förståelse av immunmekanismen. Strategier för att stoppa denna inflammatoriska process, inklusive produktion av interleukin-1-receptorantagonist (IL-1Ra) och andra antiinflammatoriska cytokiner, kan också spela en viktig roll vid ögonytsjukdomar^13,14,15.

Sedan 1998 har Orthokine, ett kommersialiserat autologt konditionerat serum (ACS), använts kliniskt hos ortopediska patienter som lider av artros (OA), reumatoid artrit (RA) och ryggradssjukdomar¹³. Jämfört med AS och PRP är behandling med kemiskt belagda glaspärlor och hypoxisk inkubation för att aktivera monocyter de specifika egenskaperna hos ACS¹⁶. Teoretiskt kan mer antiinflammatoriska faktorer utsöndras genom att lägga till överlevnadsstress i cellerna, vilket resulterar i en högre koncentration av väsentliga immunmodulerande komponenter, inklusive IL-1Ra. De förbättrade terapeutiska fördelarna med ACS vid OA, jämfört med AS, har också rapporterats¹⁷. Ögonytsjukdomar delar liknande immunbakgrund med ortopediska inflammatoriska sjukdomar i vissa avseenden. Baserat på de framgångsrika resultaten av human blodbaserad terapi inom det ortopediska området kan ACS därför ha fördelar jämfört med konventionella behandlingar i klinisk praxis genom epiteliotropa och immunmodulerande egenskaper. Även om ACS har använts i stor utsträckning vid ortopediska inflammatoriska sjukdomar, behöver dess kliniska tillämpningar inom oftalmologi fortfarande utforskas, vilket kan hindras av dess höga kostnad, brist på litteraturstöd och brist på standardisering av beredningsprocessen, vilket resulterar i olika prestanda.

I den här videoartikeln demonstrerades en ny, kostnadseffektiv och bekväm metod för att generera modifierad ACS (mACS), eller plasma rik på tillväxtfaktorer (PRGF), vilket ger en ögondroppslösning med ett jämförbart praktiskt värde med kommersialiserade ACS. De viktigaste idéerna att tillsätta antikoagulantia och utlösa blodkropparna för att utsöndra antiinflammatoriska cytokiner genom stressad inkubation behölls, men till skillnad från de kemiskt inducerade metoderna, såsom de baserade på CrSO_4-belagda glaspärlor och kommersiella kit, induceras den kritiska stressstatusen fysiskt av hypoxisk inkubation i denna metod. Dessutom tillsattes glycerol för att ge extra fördelar, inklusive en ökning av stabiliteten hos membranet i blodkroppar, upprätthållande av ett korrekt osmotiskt extracellulärt vätsketryck¹⁸ och en lämplig källa till näringsämnen vid hypoxiska förhållanden som undviker överbelastning av cellerna.

Protocol

Forskningen utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer i början av protokollavsnittet. Alla protokoll och procedurer utfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och granskades och godkändes av Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alla frivilliga informerades om studiens karaktär och undertecknade ett formulär för informerat samtycke innan de inkluderades. De förbrukningsvaror som krävs för hela försöksförfarandet presenteras i figur 1 och <stron…

Representative Results

Figur 1 och figur 2 visar de material som behövs för experimentet, och figur 3 visar de sekventiella stegen och de framgångsrika mellanprodukterna under beredningen av mACS. Först tillsattes 0,5 ml 10% glycerollösning i varje 10 ml sterilt provrör (figur 3A). Därefter erhölls 60-70 ml venöst blod från patienten och 10 ml blod injicerades i varje rör (figur 3B). P…

Discussion

I denna studie beskrivs ett protokoll för beredning av mACS och nyttan av mACS ögondroppar vid sårläkning av djurmodeller visas vidare. Den avgörande modifieringen av detta mACS-protokoll är tillsatsen av cirka 0,5 ml 10% glycerollösning i varje provrör, vilket skapar lämpliga hypoxiska förhållanden under 4 timmars inkubation vid 37 ° C. Denna inställning ger AS rätt stress och uppmanar celler att utsöndra nödvändiga tillväxtfaktorer som hjälper sårläkning. Filtret på 0,22 μm kan hjälpa till att …

Materials

96-well culture plate	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units	Becton,Dickinson and Company, US	367880	At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set	Becton,Dickinson and Company, US	367281	For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle	Cheng Yi Chemical, Taiwan	CP405141	Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium	Merck KGaA, Germany	D6429
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Incubator	Firstek, Taiwan	S300S	37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves	Kanam Latex Industries, India	EN455	For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter	Merck KGaA, Germany	PR05359	At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution	Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan	19496	To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Terumo 18 G needle	Terumo, Taiwan	SMACF0120-18BX	3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe	Terumo, Taiwan	MDSS20ES	Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle	Terumo, Taiwan	MDSS03S2325	3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004