הדמיה של מטבוליטים שזוהו במטבוליזם המרחבי של הרפואה הסינית המסורתית באמצעות DESI-MSI
Summary
במחקר זה מוצגת סדרה של שיטות להכנת דגימות DESI-MSI מצמחים, ומתואר בפירוט הליך של התקנת הרכבה של DESI, רכישת נתוני MSI ועיבודם. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במספר תנאים לרכישת מידע מטבולי מרחבי בצמחים.
Abstract
השימוש הרפואי ברפואה הסינית המסורתית נובע בעיקר מהמטבוליטים המשניים שלה. הדמיה של התפלגות מטבוליטים אלה הפכה לנושא מכריע במדעי הצמח. דימות ספקטרומטריית מסות יכול לחלץ כמויות עצומות של נתונים ולספק מידע על התפלגות מרחבית על אלה על ידי ניתוח פרוסות רקמות. עם היתרון של תפוקה גבוהה ודיוק גבוה יותר, דימות ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרוספריי ספיחה (DESI-MSI) משמש לעתים קרובות במחקר ביולוגי ובחקר הרפואה הסינית המסורתית. עם זאת, ההליכים המשמשים במחקר זה הם מסובכים ולא סבירים. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של הליכי חתך והדמיית DESI ופיתחנו שיטה חסכונית יותר לזיהוי התפלגות מטבוליטים וסיווג תרכובות אלה ברקמות צמחים, עם דגש מיוחד על תרופות סיניות מסורתיות. המחקר יקדם את השימוש ב- DESI בניתוח מטבוליטים ותקינה של רפואה סינית מסורתית / רפואה אתנית לטכנולוגיות הקשורות למחקר.
Introduction
הדמיה של התפלגות מטבוליטים הפכה לנושא מכריע במדעי הצמח, במיוחד ברפואה הסינית המסורתית, שכן היא חושפת את תהליך היווצרותם של מטבוליטים ספציפיים בתוך הצמח. בהתייחס לרפואה סינית מסורתית (TCM), הוא מספק מידע לגבי המרכיבים הפעילים ומנחה את היישום של חלקי צמח ביישומים פרמצבטיים. בדרך כלל, הדמיה של מטבוליטים מושגת על ידי הכלאה באתר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי או אימונוהיסטוכימיה, אולם מספר התרכובות שזוהו על ידי ניסויים אלה מעביר מידע כימי מוגבל. בשילוב עם צביעת רקמות, דימות ספקטרומטריית מסה (MSI) יכול לספק כמות גדולה של נתונים ולספק מידע התפלגות מרחבית של תרכובות על ידי סריקה וניתוח פרוסות רקמה ברמת מיקרון1. MSI משתמשת באנליטים לספיגה ויינון מפני הדגימה, ולאחר מכן בניתוח מסה של יוני פאזת האדים המתקבלים ויישום תוכנת הדמיה כדי לשלב את המידע ולהתוות תמונה דו-ממדית המתעדת שפע יונים ספציפי. טכנולוגיה זו יכולה לקבוע מולקולות אקסוגניות ואנדוגניות על ידי זיהוי ההתפלגות האופיינית של תרופות והמטבוליטים המושרים שלהן ברקמות היעד ובאיברים 2,3,4,5.
שיטות הדמיה שונות של טרשת נפוצה פותחו בעשורים האחרונים; הבולטים שבהם הם MSI (DESI-MSI) מבוסס יינון אלקטרוספריי ספיחה (DESI-MSI), ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) וספקטרומטריית מסת יונים משנית (SIMS)6. DESI-MSI משמש לעתים קרובות במחקר ביולוגי בשל פעולתו האטמוספרית, תפוקה גבוהה ודיוק גבוה יותר7. MALDI יושם כדי לזהות מקטע transthyretin כסמן ביולוגי נפרוטוקסי פוטנציאלי עבור gentamicin ולנתח את ההתפלגות של מטבוליט neurotoxic 1-methyl-4-phenylpyridinium לאחר ניהול של 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine במוחות עכברים 8,9. MALDI ו- DESI שימשו כדי לקבוע את ההרכב של מבנים דמויי גבישים המושרים על ידי תרופות בכליה של ארנבים במינון; מבנים אלה מורכבים בעיקר ממטבוליטים שנוצרו עקב דהמתילציה ו / או חמצון של התרופה10. בנוסף, MSI יושם בלוקליזציה של הפצה מטבולית של רעילות סמים באיברי היעד. עם זאת, התאים ברקמת הצמח שונים ושונים מבעלי חיים ודורשים הליכי חתך מיוחדים.
בצמחים, באמצעות הדמיה של MALDI, נותחה עד כה התפלגות של תרכובות שונות בגבעול חיטה (Triticum aestivum), פולי סויה (Glycine max), זרעי אורז (Oryza sativa), פרחים ושורשים של Arabidopsis thaliana וזרעי שעורה (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . מחקרים אחרונים דיווחו כי DESI-MSI מתפתח בניתוח מטבוליטים של תרופות ומוצרים טבעיים, במיוחד ב- TCMs כגון Ginkgo biloba, Fuzi ו– Artemisia annua L 19,20,21. במחקרים אלה, הפרוטוקולים להכנת דגימות חומר צמחי שונים, וחלקם דורשים ציוד מורכב יותר, כמו מיקרוטום מקפיא. ל- DESI-MSI יש דרישות מחמירות לשטיחות פני השטח של הדגימה שזוהתה. בעת ניתוח האיבר או הרקמה של חיה, המדגם נעשה בדרך כלל על ידי cryo-sectioning22. עם זאת, הליך ההקפאה הוא מסובך ויקר יותר, ולשיטת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) הנפוצה יש אות חזק בעת ההדמיה. בנוסף, רקמות המרפא של TCM משתנות; לדוגמה, השורש Salvia miltiorrhiza, המכונה Danshen בסינית, משמש רפואי, בעוד Zisu (Perilla frutescens), העלה משמש23,24. לכן, יש צורך לשפר את הליכי הכנת הדגימה כדי לקדם את השימוש של DESI בניתוח מטבוליטים עבור TCM.
כצמח רב-שנתי וכצמח TCM נפוץ, S. miltiorrhiza תועד בתחילה במונוגרפיה הרפואית העתיקה ביותר, Shennong’s Classic of Materia Medica (הידועה בשם Shennong Bencao Jing בסינית). במחקר זה, ייעלנו את הליכי החתך וההדמיה של DESI ופיתחנו שיטה חסכונית יותר לזיהוי ההתפלגות ולסיווג התרכובות ברקמות של S. miltiorrhiza. שיטה זו יכולה גם להתגבר על החסרונות הקשורים לרקמות יבשות – שהן בדרך כלל נשברות בקלות תחת מכת החנקן – ולקדם את התפתחות ה- TCM. המחקר יקדם סטנדרטיזציה של רפואה TCM/אתנית לטכנולוגיות הקשורות למחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הופעתה של טכנולוגיית טרשת נפוצה פתחה תובנה חדשה במחקר מוצרים טבעיים ברמה המולקולרית בשניםהאחרונות 24. מכשיר הטרשת הנפוצה, בעל הרגישות הגבוהה והתפוקה הגבוהה שלו, מאפשר ניתוח ממוקד ולא ממוקד של מטבוליטים במוצרים טבעיים, גם עם ריכוז עקבות25. לכן, טרשת נפוצה נמצאת כיו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז סצ’ואן (מס ‘2022NSFSC0171) ותוכנית הכישרונות Xinglin של אוניברסיטת צ’נגדו של TCM (מס ‘030058042).
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
Riferimenti
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
- Qiu, Z. -. D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
- Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
- Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
- Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
- Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
- Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
- Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
- Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
- Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
- Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
- Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
- Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
- Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
- Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
- Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
- Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
- Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
- Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
- Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
- Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
- Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
- Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
- Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
- Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
- Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
- Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
- Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
- Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
- Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
- Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).
