Visualisation des métabolites identifiés dans le métabolome spatial de la médecine traditionnelle chinoise à l’aide de DESI-MSI
Summary
Dans cette étude, une série de méthodes sont présentées pour préparer des échantillons DESI-MSI provenant d’usines, et une procédure d’installation d’assemblage DESI, d’acquisition de données MSI et de traitement est décrite en détail. Ce protocole peut être appliqué dans plusieurs conditions d’acquisition d’informations de métabolome spatial chez les plantes.
Abstract
L’utilisation médicinale de la médecine traditionnelle chinoise est principalement due à ses métabolites secondaires. La visualisation de la distribution de ces métabolites est devenue un sujet crucial en science végétale. L’imagerie par spectrométrie de masse peut extraire d’énormes volumes de données et fournir des informations de distribution spatiale à leur sujet en analysant des tranches de tissu. Avec l’avantage d’un débit élevé et d’une plus grande précision, l’imagerie par spectrométrie de masse par électronébulisation par désorption (DESI-MSI) est souvent utilisée dans la recherche biologique et dans l’étude de la médecine traditionnelle chinoise. Cependant, les procédures utilisées dans cette recherche sont compliquées et inabordables. Dans cette étude, nous avons optimisé les procédures de sectionnement et d’imagerie DESI et développé une méthode plus rentable pour identifier la distribution des métabolites et catégoriser ces composés dans les tissus végétaux, en mettant l’accent sur les médecines traditionnelles chinoises. L’étude encouragera l’utilisation du DESI dans l’analyse des métabolites et la normalisation de la médecine traditionnelle chinoise et de la médecine ethnique pour les technologies liées à la recherche.
Introduction
La visualisation de la distribution des métabolites est devenue un sujet crucial dans la science des plantes, en particulier dans la médecine traditionnelle chinoise, car elle dévoile le processus de formation de métabolites spécifiques dans la plante. En ce qui concerne la médecine traditionnelle chinoise (MTC), il fournit des informations sur les composants actifs et guide l’application des parties de plantes dans les applications pharmaceutiques. Normalement, la visualisation des métabolites est réalisée par hybridation in situ, microscopie à fluorescence ou immunohistochimie, mais le nombre de composés détectés par ces expériences transmet des informations chimiques limitées. Combinée à la coloration tissulaire, l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) peut fournir une grande quantité de données et fournir des informations sur la distribution spatiale des composés en scannant et en analysant des coupes de tissu au niveaumicronique 1. MSI utilise des analytes pour la désorption et l’ionisation de la surface de l’échantillon, suivie d’une analyse de masse des ions en phase vapeur résultants et de l’application d’un logiciel d’imagerie pour intégrer les informations et tracer une image bidimensionnelle enregistrant une abondance d’ions spécifique. Cette technologie permet de déterminer à la fois des molécules exogènes et endogènes en détectant la distribution caractéristique des médicaments et de leurs métabolites induits dans les tissus et organes cibles 2,3,4,5.
Diverses modalités d’imagerie de la SEP ont été développées au cours des dernières décennies; les plus importants d’entre eux sont le MSI basé sur l’ionisation par électropulvérisation de désorption (DESI-MSI), la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) et la spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS)6. DESI-MSI est souvent utilisé dans la recherche biologique en raison de son fonctionnement atmosphérique, de son débit élevé et de sa plus grande précision7. MALDI a été appliqué pour identifier un fragment de transthyrétine comme biomarqueur néphrotique potentiel de la gentamicine et pour analyser la distribution du métabolite neurotoxique 1-méthyl-4-phénylpyridinium après la prise en charge de la 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine dans le cerveau de souris 8,9. MALDI et DESI ont été utilisés pour déterminer la composition de structures cristallines induites par des médicaments dans le rein de lapins traités; Ces structures sont principalement composées de métabolites formés par la déméthylation et/ou l’oxydation du médicament10. De plus, le MSI a été appliqué à la localisation de la distribution métabolique de la toxicité des médicaments dans les organes cibles. Cependant, les cellules dans les tissus végétaux varient et sont différentes des animaux et nécessitent des procédures de sectionnement spéciales.
Chez les plantes, en utilisant l’imagerie MALDI, jusqu’à présent, la distribution de différents composés dans la tige de blé (Triticum aestivum), le soja (Glycine max), les graines de riz (Oryza sativa), les fleurs et racines d’Arabidopsis thaliana et les graines d’orge (Hordeum vulgare) a été analysée 11,12,13,14,15,16,17,18 . Des études récentes ont rapporté que DESI-MSI émerge dans l’analyse des métabolites des médicaments et produits naturels, en particulier dans les MTC telles que Ginkgo biloba, Fuzi et Artemisia annua L 19,20,21. Dans ces études, les protocoles de préparation des échantillons de matériel végétal diffèrent, et certains nécessitent un équipement plus complexe, comme un microtome de congélation. DESI-MSI a des exigences strictes pour la planéité de surface de l’échantillon détecté. Lors de l’analyse de l’organe ou du tissu d’un animal, l’échantillon est généralement fabriqué par cryo-sectionnement22. Cependant, la procédure de cryosection est compliquée et plus coûteuse, et la méthode de température de coupe optimale (OCT) adhésive couramment utilisée a un signal fort lors de l’imagerie. En outre, les tissus médicinaux de la MTC varient; par exemple, la racine de Salvia miltiorrhiza, connue sous le nom de Danshen en chinois, est utilisée en médecine, tandis que dans Zisu (Perilla frutescens), la feuille est utilisée23,24. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer les procédures de préparation des échantillons afin de promouvoir l’utilisation du DESI dans l’analyse des métabolites pour la MTC.
En tant qu’herbe vivace et MTC couramment utilisée, S. miltiorrhiza a été initialement enregistrée dans la plus ancienne monographie de médecine, Shennong’s Classic of Materia Medica (connu sous le nom de Shennong Bencao Jing en chinois). Dans cette étude, nous avons optimisé les procédures de sectionnement et d’imagerie DESI et développé une méthode plus rentable pour identifier la distribution et catégoriser les composés dans les tissus de S. miltiorrhiza. Cette méthode peut également pallier les inconvénients liés aux tissus secs – qu’ils se fracturent généralement facilement sous le souffle d’azote – et favoriser le développement de la MTC. L’étude favorisera la normalisation de la MTC/médecine ethnique pour les technologies liées à la recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’émergence de la technologie MS a ouvert une nouvelle perspective dans la recherche sur les produits naturels au niveau moléculaire au cours des dernières années24. L’instrument MS, avec sa sensibilité élevée et son débit élevé, permet une analyse ciblée et non ciblée des métabolites dans les produits naturels, même avec une concentration à l’état de traces25. Par conséquent, la SEP est actuellement largement utilisée dans le domaine de la chimie de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la province du Sichuan (n ° 2022NSFSC0171) et le programme de talent Xinglin de l’Université de TCM de Chengdu (n ° 030058042).
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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