Visualisierung von Metaboliten, die im räumlichen Metabolom der Traditionellen Chinesischen Medizin mit DESI-MSI identifiziert wurden
Summary
In dieser Studie wird eine Reihe von Methoden zur Aufbereitung von DESI-MSI-Proben aus Pflanzen vorgestellt und ein Verfahren der DESI-Montageinstallation, MSI-Datenerfassung und -verarbeitung detailliert beschrieben. Dieses Protokoll kann unter verschiedenen Bedingungen angewendet werden, um räumliche Metabolominformationen in Pflanzen zu erhalten.
Abstract
Die medizinische Verwendung der Traditionellen Chinesischen Medizin ist vor allem auf ihre Sekundärmetaboliten zurückzuführen. Die Visualisierung der Verteilung dieser Metaboliten ist zu einem entscheidenden Thema in der Pflanzenwissenschaft geworden. Die massenspektrometrische Bildgebung kann riesige Datenmengen extrahieren und durch die Analyse von Gewebeschnitten Informationen über die räumliche Verteilung liefern. Mit dem Vorteil eines hohen Durchsatzes und einer höheren Genauigkeit wird die Desorptions-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (DESI-MSI) häufig in der biologischen Forschung und im Studium der traditionellen chinesischen Medizin eingesetzt. Die Verfahren, die in dieser Forschung verwendet werden, sind jedoch kompliziert und nicht erschwinglich. In dieser Studie haben wir Schnitt- und DESI-Bildgebungsverfahren optimiert und eine kostengünstigere Methode entwickelt, um die Verteilung von Metaboliten zu identifizieren und diese Verbindungen in Pflanzengeweben zu kategorisieren, mit besonderem Fokus auf die traditionelle chinesische Medizin. Die Studie wird den Einsatz von DESI in der Metabolitenanalyse und die Standardisierung der Traditionellen Chinesischen Medizin/Ethnischen Medizin für forschungsnahe Technologien fördern.
Introduction
Die Visualisierung der Metabolitenverteilung ist zu einem entscheidenden Thema in der Pflanzenwissenschaft geworden, insbesondere in der traditionellen chinesischen Medizin, da sie den Bildungsprozess spezifischer Metaboliten innerhalb der Pflanze aufdeckt. In Anlehnung an die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) gibt sie Auskunft über die Wirkstoffe und leitet die Anwendung von Pflanzenteilen in pharmazeutischen Anwendungen an. Normalerweise wird die Visualisierung von Metaboliten durch In-situ-Hybridisierung, Fluoreszenzmikroskopie oder Immunhistochemie erreicht, jedoch vermittelt die Anzahl der in diesen Experimenten nachgewiesenen Verbindungen nur begrenzte chemische Informationen. In Kombination mit der Gewebefärbung kann die massenspektrometrische Bildgebung (MSI) große Datenmengen liefern und räumliche Verteilungsinformationen von Verbindungen liefern, indem Gewebeschnitte auf Mikrometerebene gescannt und analysiertwerden 1. MSI verwendet Analyten für die Desorption und Ionisation von der Probenoberfläche, gefolgt von einer Massenanalyse der resultierenden Dampfphasenionen und der Anwendung von Bildgebungssoftware, um die Informationen zu integrieren und ein zweidimensionales Bild zu zeichnen, das eine bestimmte Ionenhäufigkeit aufzeichnet. Diese Technologie kann sowohl exogene als auch endogene Moleküle bestimmen, indem sie die charakteristische Verteilung von Wirkstoffen und ihren induzierten Metaboliten in Zielgeweben und -organen detektiert 2,3,4,5.
In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene bildgebende MS-Modalitäten entwickelt. Die bekanntesten unter ihnen sind die Desorptions-Elektrospray-Ionisations-basierte MSI (DESI-MSI), die matrixgestützte Laserdesorption/-ionisation (MALDI) und die Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS)6. DESI-MSI wird aufgrund seines atmosphärischen Betriebs, seines hohen Durchsatzes und seiner höheren Genauigkeit häufig in der biologischen Forschung eingesetzt7. MALDI wurde eingesetzt, um ein Transthyretinfragment als potentiellen nephrotoxischen Biomarker für Gentamicin zu identifizieren und die Verteilung des neurotoxischen Metaboliten 1-Methyl-4-phenylpyridinium nach der Behandlung von 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin im Mäusegehirn zu analysieren 8,9. MALDI und DESI wurden verwendet, um die Zusammensetzung von medikamenteninduzierten kristallartigen Strukturen in der Niere von dosierten Kaninchen zu bestimmen. Diese Strukturen bestehen hauptsächlich aus Metaboliten, die durch die Demethylierung und/oder Oxidation des Wirkstoffs10 gebildet werden. Darüber hinaus wurde MSI zur Lokalisierung der metabolischen Verteilung von Arzneimitteltoxizität in Zielorganen eingesetzt. Die Zellen im Pflanzengewebe variieren jedoch und unterscheiden sich von Tieren und erfordern spezielle Schnittverfahren.
In Pflanzen wurde bisher mit Hilfe der MALDI-Bildgebung die Verteilung verschiedener Verbindungen in Weizensamen (Triticum aestivum), Sojabohnen (Glycine max), Reissamen (Oryza sativa), Arabidopsis thaliana-Blüten und -Wurzeln sowie Gerstensamen (Hordeum vulgare) analysiert 11,12,13,14,15,16,17,18 . Jüngste Studien haben gezeigt, dass DESI-MSI in der Metabolitenanalyse von natürlichen Arzneimitteln und Produkten auftaucht, insbesondere in TCMs wie Ginkgo biloba, Fuzi und Artemisia annua L 19,20,21. In diesen Studien unterscheiden sich die Protokolle für die Aufbereitung von Pflanzenmaterialproben, und einige erfordern komplexere Geräte, wie z. B. ein Mikrotom zum Einfrieren. DESI-MSI stellt strenge Anforderungen an die Oberflächenebenheit der detektierten Probe. Bei der Analyse des Organs oder Gewebes eines Tieres wird die Probe in der Regel durch Kryoschnitt22 hergestellt. Das Verfahren für die Kryoschnitte ist jedoch kompliziert und teurer, und die häufig verwendete Methode der optimalen Schneidtemperatur (OCT) des Klebstoffs hat ein starkes Signal bei der Bildgebung. Darüber hinaus variieren die medizinischen Gewebe der TCM; Zum Beispiel wird die Wurzel von Salvia miltiorrhiza, die auf Chinesisch als Danshen bekannt ist, medizinisch verwendet, während bei Zisu (Perilla frutescens) das Blatt verwendet wird23,24. Daher ist es notwendig, die Probenvorbereitungsverfahren zu verbessern, um den Einsatz von DESI in der Metabolitenanalytik für die TCM zu fördern.
Als mehrjähriges Kraut und häufig verwendetes TCM wurde S. miltiorrhiza ursprünglich in der ältesten medizinischen Monographie, Shennong’s Classic of Materia Medica (auf Chinesisch als Shennong Bencao Jing bekannt), aufgezeichnet. In dieser Studie haben wir Schnitt- und DESI-Bildgebungsverfahren optimiert und eine kostengünstigere Methode entwickelt, um die Verteilung und Kategorisierung der Verbindungen in Geweben von S. miltiorrhiza zu identifizieren. Diese Methode kann auch die Nachteile von trockenem Gewebe überwinden – dass es unter dem Stickstoffschlag normalerweise leicht bricht – und die Entwicklung der TCM fördern. Die Studie wird die Standardisierung der TCM/ethnischen Medizin für forschungsnahe Technologien vorantreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Aufkommen der MS-Technologie hat in den letzten Jahren neue Erkenntnisse in der Naturstoffforschung auf molekularer Ebene eröffnet24. Das MS-Gerät ermöglicht mit seiner hohen Empfindlichkeit und seinem hohen Durchsatz die gezielte und ungezielte Analyse von Metaboliten in Naturstoffen, auch bei Spurenkonzentrationen25. Daher ist MS derzeit im Bereich der Chemie der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) weit verbreitet. Die qualitative und quantitative Forschung z…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Sichuan (Nr. 2022NSFSC0171) und dem Xinglin Talent Program der Chengdu University of TCM (Nr. 030058042) unterstützt.
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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