Visualización de metabolitos identificados en el metaboloma espacial de la medicina tradicional china utilizando DESI-MSI
Summary
En este estudio, se presentan una serie de métodos para preparar muestras DESI-MSI de plantas, y se describe en detalle un procedimiento de instalación de ensamblaje DESI, adquisición de datos MSI y procesamiento. Este protocolo se puede aplicar en varias condiciones para adquirir información de metaboloma espacial en plantas.
Abstract
El uso medicinal de la medicina tradicional china se debe principalmente a sus metabolitos secundarios. La visualización de la distribución de estos metabolitos se ha convertido en un tema crucial en la ciencia de las plantas. Las imágenes de espectrometría de masas pueden extraer grandes volúmenes de datos y proporcionar información de distribución espacial sobre estos mediante el análisis de cortes de tejido. Con la ventaja de un alto rendimiento y una mayor precisión, las imágenes de espectrometría de masas de ionización por electrospray de desorción (DESI-MSI) se utilizan a menudo en la investigación biológica y en el estudio de la medicina tradicional china. Sin embargo, los procedimientos utilizados en esta investigación son complicados y no asequibles. En este estudio, optimizamos los procedimientos de seccionamiento e imágenes DESI y desarrollamos un método más rentable para identificar la distribución de metabolitos y categorizar estos compuestos en tejidos vegetales, con un enfoque especial en las medicinas tradicionales chinas. El estudio promoverá la utilización de DESI en el análisis de metabolitos y la estandarización de la medicina tradicional china / medicina étnica para tecnologías relacionadas con la investigación.
Introduction
La visualización de la distribución de metabolitos se ha convertido en un tema crucial en la ciencia de las plantas, especialmente en la medicina tradicional china, ya que revela el proceso de formación de metabolitos específicos dentro de la planta. Con referencia a la medicina tradicional china (MTC), proporciona información sobre los componentes activos y guía la aplicación de partes de plantas en aplicaciones farmacéuticas. Normalmente, la visualización de metabolitos se logra mediante hibridación in situ, microscopía de fluorescencia o inmunohistoquímica, sin embargo, el número de compuestos detectados por estos experimentos transmite información química limitada. Combinadas con la tinción tisular, las imágenes por espectrometría de masas (MSI) pueden proporcionar una gran cantidad de datos y proporcionar información de distribución espacial de compuestos mediante el escaneo y análisis de cortes de tejido a nivel de micras1. MSI utiliza analitos para la desorción e ionización de la superficie de la muestra, seguido de un análisis de masa de los iones de fase de vapor resultantes y la aplicación de software de imágenes para integrar la información y trazar una imagen bidimensional que registra una abundancia de iones específica. Esta tecnología puede determinar moléculas exógenas y endógenas mediante la detección de la distribución característica de los fármacos y sus metabolitos inducidos en los tejidos y órganos diana 2,3,4,5.
En las últimas décadas se han desarrollado varias modalidades de imágenes de EM; los más destacados entre ellos son el MSI basado en ionización por electrospray de desorción (desi-MSI), la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)6. DESI-MSI se utiliza a menudo en la investigación biológica debido a su funcionamiento atmosférico, alto rendimiento y mayor precisión7. MALDI se ha aplicado para identificar un fragmento de transtiretina como un potencial biomarcador nefrotóxico para gentamicina y para analizar la distribución del metabolito neurotóxico 1-metil-4-fenilpiridinio después del manejo de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina en cerebros de ratones 8,9. MALDI y DESI se han utilizado para determinar la composición de estructuras cristalinas inducidas por fármacos en el riñón de conejos dosificados; Estas estructuras están compuestas principalmente por metabolitos formados debido a la desmetilación y/u oxidación del fármaco10. Además, MSI se ha aplicado en la localización de la distribución metabólica de la toxicidad del fármaco en órganos diana. Sin embargo, las células en el tejido vegetal varían y son diferentes de los animales y requieren procedimientos especiales de seccionamiento.
En plantas, mediante el uso de imágenes MALDI, hasta el momento, se ha analizado la distribución de diferentes compuestos en el tallo del trigo (Triticum aestivum), las semillas de soja (Glycine max), arroz (Oryza sativa), las flores y raíces de Arabidopsis thaliana y las semillas de cebada (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . Estudios recientes han informado que DESI-MSI está emergiendo en el análisis de metabolitos de medicamentos y productos naturales, especialmente en MTC como Ginkgo biloba, Fuzi y Artemisia annua L 19,20,21. En estos estudios, los protocolos para la preparación de muestras de material vegetal difieren, y algunos requieren equipos más complejos, como un micrótomo de congelación. DESI-MSI tiene requisitos estrictos para la planitud superficial de la muestra detectada. Cuando se analiza el órgano o tejido de un animal, la muestra generalmente se realiza mediante criosección22. Sin embargo, el procedimiento para la criosección es complicado y más costoso, y el método de temperatura óptima de corte (OCT) del adhesivo comúnmente utilizado tiene una señal fuerte cuando se toman imágenes. Además, los tejidos medicinales de la MTC varían; por ejemplo, la raíz de Salvia miltiorrhiza, conocida como Danshen en chino, se usa medicinalmente, mientras que en Zisu (Perilla frutescens), la hoja se usa23,24. Por lo tanto, es necesario mejorar los procedimientos de preparación de muestras para promover la utilización de DESI en el análisis de metabolitos para la MTC.
Como hierba perenne y una MTC de uso común, S. miltiorrhiza se registró inicialmente en la monografía de medicina más antigua, Shennong’s Classic of Materia Medica (conocida como Shennong Bencao Jing en chino). En este estudio, optimizamos los procedimientos de seccionamiento e imagen DESI y desarrollamos un método más rentable para identificar la distribución y categorizar los compuestos en tejidos de S. miltiorrhiza. Este método también puede superar las desventajas asociadas con los tejidos secos, que generalmente se fracturan fácilmente bajo el golpe de nitrógeno, y promover el desarrollo de la MTC. El estudio promoverá la estandarización de la medicina tradicional china y étnica para las tecnologías relacionadas con la investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aparición de la tecnología MS ha abierto una nueva visión en la investigación de productos naturales a nivel molecular durante los últimos años24. El instrumento MS, con su alta sensibilidad y alto rendimiento, permite el análisis dirigido y no dirigido de metabolitos en productos naturales, incluso con concentración de trazas25. Por lo tanto, la EM es actualmente ampliamente utilizada en el campo de la química de la medicina tradicional china (MTC). La investig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Sichuan (No. 2022NSFSC0171) y el Programa de Talento Xinglin de la Universidad de Chengdu de TCM (No. 030058042).
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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