Visualização de Metabólitos Identificados no Metaboloma Espacial da Medicina Tradicional Chinesa Utilizando DESI-MSI
Summary
Neste estudo, uma série de métodos são apresentados para preparar amostras de DESI-MSI de plantas, e um procedimento de instalação de montagem de DESI, aquisição de dados MSI e processamento é descrito em detalhes. Este protocolo pode ser aplicado em diversas condições para aquisição de informações do metaboloma espacial em plantas.
Abstract
O uso medicinal da medicina tradicional chinesa deve-se principalmente aos seus metabólitos secundários. A visualização da distribuição desses metabólitos tornou-se um tópico crucial na ciência vegetal. A espectrometria de massa pode extrair grandes volumes de dados e fornecer informações de distribuição espacial sobre eles por meio da análise de fatias de tecido. Com a vantagem de alto rendimento e maior precisão, a imagem por espectrometria de massa por ionização por eletrospray de dessorção (DESI-MSI) é frequentemente usada em pesquisas biológicas e no estudo da medicina tradicional chinesa. No entanto, os procedimentos utilizados nesta pesquisa são complicados e pouco acessíveis. Neste estudo, otimizamos os procedimentos de corte e imagem DESI e desenvolvemos um método mais custo-efetivo para identificar a distribuição de metabólitos e categorizar esses compostos em tecidos vegetais, com foco especial na medicina tradicional chinesa. O estudo promoverá a utilização do DESI na análise de metabólitos e padronização da medicina tradicional chinesa/medicina étnica para tecnologias relacionadas à pesquisa.
Introduction
A visualização da distribuição de metabólitos tornou-se um tópico crucial na ciência vegetal, especialmente na medicina tradicional chinesa, pois revela o processo de formação de metabólitos específicos dentro da planta. Com referência à medicina tradicional chinesa (MTC), fornece informações sobre os componentes ativos e orienta a aplicação de partes de plantas em aplicações farmacêuticas. Normalmente, a visualização dos metabólitos é obtida por hibridização in situ, microscopia de fluorescência ou imunohistoquímica, porém o número de compostos detectados por esses experimentos transmite informações químicas limitadas. Combinada com a coloração tecidual, a imagem por espectrometria de massa (MSI) pode fornecer uma grande quantidade de dados e fornecer informações de distribuição espacial de compostos por meio da varredura e análise de cortes de tecidono nível 1 da mícron. O MSI usa analitos para dessorção e ionização da superfície da amostra, seguido de análise de massa dos íons de fase vapor resultantes e aplicação de software de imagem para integrar as informações e plotar uma imagem bidimensional registrando uma abundância específica de íons. Essa tecnologia pode determinar moléculas exógenas e endógenas por meio da detecção da distribuição característica de fármacos e seus metabólitos induzidos em tecidos e órgãos-alvo 2,3,4,5.
Várias modalidades de imagem da EM foram desenvolvidas nas últimas décadas; os mais proeminentes entre eles são o MSI BASEADO EM IONIZAÇÃO POR ELETROSPRAY DE DESSORÇÃO (DESI-MSI), dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) e espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)6. O DESI-MSI é frequentemente utilizado em pesquisas biológicas devido à sua operação atmosférica, alto rendimento e maior precisão7. O MALDI tem sido aplicado para identificar um fragmento de transtirretina como potencial biomarcador nefrotóxico para gentamicina e para analisar a distribuição do metabólito neurotóxico 1-metil-4-fenilpiridínio após o manejo de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina em cérebros de camundongos 8,9. MALDI e DESI têm sido usados para determinar a composição de estruturas cristalinas induzidas por drogas no rim de coelhos dosados; Essas estruturas são compostas principalmente por metabólitos formados devido à desmetilação e/ou oxidação do fármaco10. Adicionalmente, o MSI tem sido aplicado na localização da distribuição metabólica da toxicidade de drogas em órgãos-alvo. No entanto, as células do tecido vegetal variam e são diferentes dos animais e requerem procedimentos especiais de seccionamento.
Em plantas, utilizando imagens MALDI, até o momento, foi analisada a distribuição de diferentes compostos em caule de trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), sementes de arroz (Oryza sativa), flores e raízes de Arabidopsis thaliana e sementes de cevada (Hordeum vulgare)11,12,13,14,15,16,17,18 . Estudos recentes relatam que o DESI-MSI está emergindo na análise de metabólitos de drogas e produtos naturais, especialmente em MTCs como Ginkgo biloba, Fuzi e Artemisia annua L 19,20,21. Nesses estudos, os protocolos para a preparação de amostras de material vegetal diferem e alguns requerem equipamentos mais complexos, como um micrótomo de congelamento. O DESI-MSI tem requisitos rigorosos para a planicidade superficial da amostra detectada. Ao analisar o órgão ou tecido de um animal, a amostra geralmente é feita por criossecção22. No entanto, o procedimento para criosseccionamento é complicado e mais caro, e o método de temperatura de corte ótima (OCT) comumente usado com adesivo tem um forte sinal durante a obtenção de imagens. Além disso, os tecidos medicinais da MTC variam; por exemplo, a raiz de Salvia miltiorrhiza, conhecida como Danshen em chinês, é usada medicinalmente, enquanto em Zisu (Perilla frutescens), a folha é usada23,24. Portanto, é necessário melhorar os procedimentos de preparação da amostra para promover a utilização do DESI na análise de metabólitos para MTC.
Como uma erva perene e uma MTC comumente usada, S. miltiorrhiza foi inicialmente registrada na monografia de medicina mais antiga, Shennong’s Classic of Materia Medica (conhecido como Shennong Bencao Jing em chinês). Neste estudo, otimizamos os procedimentos de corte e imagem DESI e desenvolvemos um método mais custo-efetivo para identificar a distribuição e categorizar os compostos nos tecidos de S. miltiorrhiza. Este método também pode superar as desvantagens associadas aos tecidos secos – que geralmente fraturam facilmente sob o golpe de nitrogênio – e promover o desenvolvimento da MTC. O estudo promoverá a padronização da MTC/medicina étnica para tecnologias relacionadas à pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O surgimento da tecnologia MS abriu uma nova visão na pesquisa de produtos naturais em nível molecular durante os últimos anos24. O instrumento MS, com sua alta sensibilidade e alto rendimento, permite a análise direcionada e não direcionada de metabólitos em produtos naturais, mesmo com traços de concentração25. Portanto, a EM é atualmente amplamente utilizada no campo da química da medicina tradicional chinesa (MTC). A pesquisa qualitativa e quantitativa sobre …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da província de Sichuan (No. 2022NSFSC0171) e pelo Programa de Talentos Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (No. 030058042).
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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