Visualisering af metabolitter identificeret i det rumlige metabolom af traditionel kinesisk medicin ved hjælp af DESI-MSI
Summary
I denne undersøgelse præsenteres en række metoder til forberedelse af DESI-MSI-prøver fra anlæg, og en procedure for DESI-monteringsinstallation, MSI-dataindsamling og behandling beskrives detaljeret. Denne protokol kan anvendes under flere betingelser for erhvervelse af rumlig metabolominformation i planter.
Abstract
Den medicinske anvendelse af traditionel kinesisk medicin skyldes hovedsageligt dets sekundære metabolitter. Visualisering af fordelingen af disse metabolitter er blevet et afgørende emne inden for plantevidenskab. Massespektrometribilleddannelse kan udtrække enorme mængder data og give rumlig distributionsinformation om disse ved at analysere vævsskiver. Med fordelen ved høj gennemstrømning og højere nøjagtighed anvendes desorptionselektrosprayionisering massespektrometribilleddannelse (DESI-MSI) ofte i biologisk forskning og i studiet af traditionel kinesisk medicin. De procedurer, der anvendes i denne forskning, er imidlertid komplicerede og ikke overkommelige. I denne undersøgelse optimerede vi sektions- og DESI-billeddannelsesprocedurer og udviklede en mere omkostningseffektiv metode til at identificere fordelingen af metabolitter og kategorisere disse forbindelser i plantevæv med særlig fokus på traditionel kinesisk medicin. Undersøgelsen vil fremme anvendelsen af DESI i metabolitanalyse og standardisering af traditionel kinesisk medicin / etnisk medicin til forskningsrelaterede teknologier.
Introduction
Visualisering af metabolitfordeling er blevet et afgørende emne inden for plantevidenskab, især i traditionel kinesisk medicin, da det afslører dannelsesprocessen af specifikke metabolitter i planten. Med henvisning til traditionel kinesisk medicin (TCM) giver den information om de aktive komponenter og styrer anvendelsen af plantedele i farmaceutiske applikationer. Normalt opnås visualisering af metabolitter ved in situ-hybridisering, fluorescensmikroskopi eller immunhistokemi, men antallet af forbindelser detekteret ved disse eksperimenter formidler begrænset kemisk information. Kombineret med vævsfarvning kan massespektrometribilleddannelse (MSI) give store mængder data og levere rumlig fordelingsinformation om forbindelser ved at scanne og analysere vævsskiver på mikronniveau1. MSI bruger analysander til desorption og ionisering fra prøveoverfladen efterfulgt af masseanalyse af de resulterende dampfaseioner og anvendelse af billeddannelsessoftware til at integrere informationen og plotte et todimensionelt billede, der registrerer en specifik ionoverflod. Denne teknologi kan bestemme både eksogene og endogene molekyler ved at detektere den karakteristiske fordeling af lægemidler og deres inducerede metabolitter i målvæv og organer 2,3,4,5.
Forskellige billeddannende MS-modaliteter er blevet udviklet i løbet af de seneste årtier; de mest fremtrædende blandt dem er desorptionselektrospray ioniseringsbaseret MSI (DESI-MSI), matrixassisteret laserdesorption / ionisering (MALDI) og sekundær ionmassespektrometri (SIMS)6. DESI-MSI bruges ofte i biologisk forskning på grund af dets atmosfæriske drift, høje gennemstrømning og højere nøjagtighed7. MALDI er blevet anvendt til at identificere et transthyretinfragment som en potentiel nefrotoksisk biomarkør for gentamicin og til at analysere fordelingen af den neurotoksiske metabolit 1-methyl-4-phenylpyridinium efter behandling af 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin i musehjerner 8,9. MALDI og DESI er blevet anvendt til at bestemme sammensætningen af lægemiddelinducerede krystallignende strukturer i nyrerne hos doserede kaniner; Disse strukturer består hovedsageligt af metabolitter dannet på grund af demethylering og/eller oxidation af lægemidlet10. Derudover er MSI blevet anvendt til lokalisering af metabolisk fordeling af lægemiddeltoksicitet i målorganer. Imidlertid varierer cellerne i plantevæv og er forskellige fra dyr og kræver særlige sektionsprocedurer.
I planter, ved hjælp af MALDI billeddannelse, indtil videre, fordelingen af forskellige forbindelser i hvede (Triticum aestivum) stamme, sojabønne (Glycine max), ris (Oryza sativa) frø, Arabidopsis thaliana blomster og rødder, og byg (Hordeum vulgare) frø er blevet analyseret 11,12,13,14,15,16,17,18 . Nylige undersøgelser har rapporteret, at DESI-MSI dukker op i metabolitanalysen af naturlige lægemidler og produkter, især i TCM’er som Ginkgo biloba, Fuzi og Artemisia annua L 19,20,21. I disse undersøgelser er protokollerne til fremstilling af plantematerialeprøver forskellige, og nogle kræver mere komplekst udstyr, som et frysemikrotom. DESI-MSI har strenge krav til overfladefladheden af den detekterede prøve. Ved analyse af et dyrs organ eller væv fremstilles prøven normalt ved kryo-sektionering22. Proceduren for kryosektionering er imidlertid kompliceret og dyrere, og den almindeligt anvendte metode til optimal klæbemiddelskæretemperatur (OCT) har et stærkt signal ved billeddannelse. Derudover varierer TCM’s medicinske væv; for eksempel bruges roden til Salvia miltiorrhiza, kendt som Danshen på kinesisk, medicinsk, mens bladet i Zisu (Perilla frutescens) bruges23,24. Det er derfor nødvendigt at forbedre procedurerne for prøveforberedelse for at fremme anvendelsen af DESI i metabolitanalyse for TCM.
Som en flerårig urt og en almindeligt anvendt TCM blev S. miltiorrhiza oprindeligt optaget i den ældste medicinmonografi, Shennong’s Classic of Materia Medica (kendt som Shennong Bencao Jing på kinesisk). I denne undersøgelse optimerede vi sektions- og DESI-billeddannelsesprocedurer og udviklede en mere omkostningseffektiv metode til at identificere fordelingen og kategorisere forbindelserne i væv fra S. miltiorrhiza. Denne metode kan også overvinde ulemperne forbundet med tørt væv – at de normalt let bryder under nitrogenblæsningen – og fremme udviklingen af TCM. Undersøgelsen vil fremme standardiseringen af TCM / etnisk medicin til forskningsrelaterede teknologier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremkomsten af MS-teknologi har åbnet en ny indsigt i naturproduktforskning på molekylært niveau i de senere år24. MS-instrumentet muliggør med sin høje følsomhed og høje kapacitet målrettet og ikke-målrettet analyse af metabolitter i naturlige produkter, selv med sporkoncentration25. Derfor er MS i øjeblikket meget udbredt inden for traditionel kinesisk medicin (TCM) kemi. Den kvalitative og kvantitative forskning i TCM’s kemiske sammensætning kan give oplysnin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of Sichuan-provinsen (nr. 2022NSFSC0171) og Xinglin Talent Program fra Chengdu University of TCM (nr. 030058042).
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
Riferimenti
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
- Qiu, Z. -. D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
- Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
- Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
- Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
- Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
- Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
- Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
- Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
- Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
- Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
- Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
- Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
- Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
- Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
- Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
- Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
- Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
- Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
- Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
- Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
- Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
- Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
- Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
- Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
- Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
- Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
- Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
- Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
- Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
- Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).
