Visualizzazione dei metaboliti identificati nel metaboloma spaziale della medicina tradizionale cinese utilizzando DESI-MSI
Summary
In questo studio, viene presentata una serie di metodi per preparare campioni DESI-MSI dagli impianti e viene descritta in dettaglio una procedura di installazione dell’assemblaggio DESI, acquisizione dei dati MSI ed elaborazione. Questo protocollo può essere applicato in diverse condizioni per l’acquisizione di informazioni sul metaboloma spaziale nelle piante.
Abstract
L’uso medicinale della medicina tradizionale cinese è dovuto principalmente ai suoi metaboliti secondari. La visualizzazione della distribuzione di questi metaboliti è diventata un argomento cruciale nella scienza delle piante. La spettrometria di massa può estrarre enormi volumi di dati e fornire informazioni sulla distribuzione spaziale su questi analizzando fette di tessuto. Con il vantaggio di un’elevata produttività e di una maggiore precisione, l’imaging con spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray a desorbimento (DESI-MSI) viene spesso utilizzato nella ricerca biologica e nello studio della medicina tradizionale cinese. Tuttavia, le procedure utilizzate in questa ricerca sono complicate e non accessibili. In questo studio, abbiamo ottimizzato le procedure di sezionamento e imaging DESI e sviluppato un metodo più economico per identificare la distribuzione dei metaboliti e classificare questi composti nei tessuti vegetali, con particolare attenzione alle medicine tradizionali cinesi. Lo studio promuoverà l’utilizzo del DESI nell’analisi dei metaboliti e nella standardizzazione della medicina tradizionale cinese / medicina etnica per le tecnologie legate alla ricerca.
Introduction
La visualizzazione della distribuzione dei metaboliti è diventata un argomento cruciale nella scienza delle piante, specialmente nella medicina tradizionale cinese, in quanto svela il processo di formazione di specifici metaboliti all’interno della pianta. Con riferimento alla medicina tradizionale cinese (MTC), fornisce informazioni sui componenti attivi e guida l’applicazione di parti di piante in applicazioni farmaceutiche. Normalmente, la visualizzazione dei metaboliti si ottiene mediante ibridazione in situ, microscopia a fluorescenza o immunoistochimica, tuttavia il numero di composti rilevati da questi esperimenti trasmette informazioni chimiche limitate. In combinazione con la colorazione dei tessuti, la spettrometria di massa (MSI) può fornire una grande quantità di dati e fornire informazioni sulla distribuzione spaziale dei composti scansionando e analizzando fette di tessuto a livello di micron1. MSI utilizza analiti per il desorbimento e la ionizzazione dalla superficie del campione, seguiti dall’analisi di massa degli ioni di fase vapore risultanti e dall’applicazione di software di imaging per integrare le informazioni e tracciare un’immagine bidimensionale che registra una specifica abbondanza di ioni. Questa tecnologia può determinare sia molecole esogene che endogene rilevando la distribuzione caratteristica dei farmaci e dei loro metaboliti indotti nei tessuti e negli organi bersaglio 2,3,4,5.
Negli ultimi decenni sono state sviluppate varie modalità di imaging della SM; i più importanti tra questi sono MSI (DESI-MSI) basato sulla ionizzazione elettrospray di desorbimento, desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) e spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS)6. DESI-MSI è spesso utilizzato nella ricerca biologica grazie al suo funzionamento atmosferico, all’elevata produttività e alla maggiore precisione7. MALDI è stato applicato per identificare un frammento di transtiretina come potenziale biomarcatore nefrotossico per la gentamicina e per analizzare la distribuzione del metabolita neurotossico 1-metil-4-fenilpiridinio dopo la gestione di 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina nel cervello di topo 8,9. MALDI e DESI sono stati utilizzati per determinare la composizione di strutture cristalline indotte da farmaci nel rene di conigli dosati; Queste strutture sono composte principalmente da metaboliti formati a causa della demetilazione e/o ossidazione del farmaco10. Inoltre, l’MSI è stato applicato nella localizzazione della distribuzione metabolica della tossicità dei farmaci negli organi bersaglio. Tuttavia, le cellule nel tessuto vegetale variano e sono diverse dagli animali e richiedono speciali procedure di sezionamento.
Nelle piante, utilizzando l’imaging MALDI, finora, è stata analizzata la distribuzione di diversi composti nel fusto di grano (Triticum aestivum), semi di soia (Glycine max), semi di riso (Oryza sativa), fiori e radici di Arabidopsis thaliana e semi di orzo (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . Studi recenti hanno riportato che DESI-MSI sta emergendo nell’analisi dei metaboliti di farmaci e prodotti naturali, specialmente in MTC come Ginkgo biloba, Fuzi e Artemisia annua L 19,20,21. In questi studi, i protocolli per la preparazione di campioni di materiale vegetale differiscono e alcuni richiedono attrezzature più complesse, come un microtomo di congelamento. DESI-MSI ha requisiti rigorosi per la planarità superficiale del campione rilevato. Quando si analizza l’organo o il tessuto di un animale, il campione viene solitamente realizzato mediante crio-sezione22. Tuttavia, la procedura per la criosezione è complicata e più costosa e il metodo comunemente usato della temperatura di taglio ottimale dell’adesivo (OCT) ha un segnale forte durante l’imaging. Inoltre, i tessuti medicinali della MTC variano; ad esempio, la radice di Salvia miltiorrhiza, conosciuta come Danshen in cinese, è usata in medicina, mentre in Zisu (Perilla frutescens), la foglia è usata23,24. Pertanto, è necessario migliorare le procedure di preparazione del campione per promuovere l’utilizzo del DESI nell’analisi dei metaboliti per la MTC.
Come erba perenne e MTC comunemente usata, S. miltiorrhiza è stata inizialmente registrata nella più antica monografia di medicina, Shennong’s Classic of Materia Medica (conosciuta come Shennong Bencao Jing in cinese). In questo studio, abbiamo ottimizzato le procedure di sezionamento e imaging DESI e sviluppato un metodo più economico per identificare la distribuzione e classificare i composti nei tessuti di S. miltiorrhiza. Questo metodo può anche superare gli svantaggi associati ai tessuti asciutti – che di solito si fratturano facilmente sotto il colpo di azoto – e promuovere lo sviluppo della MTC. Lo studio promuoverà la standardizzazione della MTC/medicina etnica per le tecnologie legate alla ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’emergere della tecnologia SM ha aperto una nuova visione della ricerca sui prodotti naturali a livello molecolare negli ultimi anni24. Lo strumento MS, con la sua elevata sensibilità e l’elevata produttività, consente analisi mirate e non mirate di metaboliti in prodotti naturali, anche con concentrazione di tracce25. Pertanto, la SM è attualmente ampiamente utilizzata nel campo della chimica della medicina tradizionale cinese (MTC). La ricerca qualitativa e quantitati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia del Sichuan (n. 2022NSFSC0171) e dallo Xinglin Talent Program dell’Università di Chengdu di TCM (n. 030058042).
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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