DESI-MSIを用いた漢方薬の空間メタボロームで同定された代謝物の可視化
Summary
本研究では、プラントからDESI-MSIサンプルを調製するための一連の方法を提示し、DESIアセンブリの設置、MSIデータの取得、および処理の手順を詳細に説明します。このプロトコルは、植物における空間メタボローム情報を取得するためのいくつかの条件に適用することができる。
Abstract
伝統的な漢方薬の薬用使用は、主にその二次代謝産物によるものです。これらの代謝産物の分布の可視化は、植物科学において重要なテーマとなっています。質量分析イメージングは、組織スライスを分析することにより、膨大な量のデータを抽出し、これらに関する空間分布情報を提供できます。高スループットと高精度の利点により、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング(DESI-MSI)は、生物学研究や伝統的な漢方薬の研究でよく使用されます。ただし、この研究で使用される手順は複雑で手頃な価格ではありません。この研究では、切片作成とDESIイメージング手順を最適化し、代謝物の分布を特定し、植物組織中のこれらの化合物を分類するためのより費用効果の高い方法を開発しました。本研究では、代謝物分析におけるDESIの活用と、研究関連技術のための伝統的な漢方薬/民族医学の標準化を促進します。
Introduction
代謝物分布の可視化は、植物科学、特に漢方薬において、植物内の特定の代謝物の形成過程を明らかにする重要なトピックとなっています。伝統的な漢方薬(TCM)を参照して、有効成分に関する情報を提供し、製薬用途における植物部品の応用をガイドします。通常、代謝物の可視化はin situハイブリダイゼーション、蛍光顕微鏡、免疫組織化学などによって行われますが、これらの実験で検出される化合物の数では、限られた化学情報しか伝えられません。組織染色と組み合わせることで、質量分析イメージング(MSI)は、ミクロンレベル1の組織スライスをスキャンして分析することにより、大量のデータを提供し、化合物の空間分布情報を提供できます。MSIは、サンプル表面からの脱離とイオン化に分析物を使用し、その後、得られた気相イオンの質量分析とイメージングソフトウェアの適用により、情報を統合し、特定のイオン存在量を記録した2次元画像をプロットします。この技術は、標的組織および器官における薬物およびそれらの誘導代謝産物の特徴的な分布を検出することにより、外因性分子および内因性分子の両方を決定することができる2,3,4,5。
さまざまなイメージングMSモダリティがここ数十年にわたって開発されてきました。その中で最も顕著なのは、脱離エレクトロスプレーイオン化ベースのMSI(DESI-MSI)、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)、および二次イオン質量分析(SIMS)6です。DESI-MSIは、大気中での操作、高いスループット、およびより高い精度により、生物学研究でよく使用されます7。MALDIは、トランスサイレチンフラグメントをゲンタマイシンの潜在的な腎毒性バイオマーカーとして特定し、マウス脳における1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンの管理後の神経毒性代謝物1-メチル-4-フェニルピリジニウムの分布を分析するために適用されています8,9。MALDIおよびDESIは、投与されたウサギの腎臓における薬物誘発性結晶様構造の組成を決定するために使用されています。これらの構造は、主に薬物10の脱メチル化および/または酸化によって形成される代謝産物から構成される。さらに、MSIは、標的臓器における薬物毒性の代謝分布の局在化に適用されています。ただし、植物組織の細胞はさまざまであり、動物とは異なり、特別な切片作成手順が必要です。
植物では、MALDIイメージングを用いて、これまでに、コムギ(Triticum aestivum)茎、ダイヤ豆(Glycine max)、イネ(Oryza sativa)種子、シロイヌナズナの花と根、および大麦(Hordeum vulgare)種子における異なる化合物の分布が分析されている11,12,13,14,15,16,17,18.最近の研究では、DESI-MSIが天然の薬物および製品の代謝物分析、特にイチョウ葉、フジ、アルテミシアアヌアL 19,20,21などのTCMで出現していることが報告されています。これらの研究では、植物材料サンプルの調製のためのプロトコルが異なり、凍結ミクロトームのようなより複雑な装置を必要とするものもあります。DESI-MSIには、検出されたサンプルの表面平坦性に関する厳しい要件があります。動物の臓器または組織を分析する場合、サンプルは通常、凍結切片22によって作製される。ただし、凍結切片作成の手順は複雑で費用がかかり、一般的に使用される接着剤最適切断温度(OCT)法は、イメージング時に強い信号を示します。さらに、TCMの薬用組織はさまざまです。たとえば、中国語で丹生として知られるサルビアミルティオルリザの根は薬用に使用されますが、Zisu(シソフルテッセンス)では葉が使用されます23,24。したがって、TCMの代謝物分析におけるDESIの利用を促進するために、サンプル調製手順を改善する必要があります。
多年生のハーブおよび一般的に使用されるTCMとして、 S. miltiorrhiza は最初に最も古い医学モノグラフである神農のマテリアメディカの古典(中国語で神農ベンカオジンとして知られている)に記録されました。この研究では、切片作成とDESIイメージング手順を最適化し、 S. miltiorrhizaの組織中の分布を特定し、化合物を分類するためのより費用効果の高い方法を開発しました。この方法はまた、乾燥組織に関連する欠点(通常は窒素ブローで容易に骨折する)を克服し、TCMの発症を促進することができます。本研究では、研究関連技術のためのTCM/民族医学の標準化を推進します。
Protocol
Representative Results
Discussion
MS技術の出現は、近年の分子レベルでの天然物研究に新しい洞察を開きました24。高感度と高スループットを備えたMS装置は、微量濃度25でも天然物中の代謝物の標的分析と非標的分析を可能にします。したがって、MSは現在、伝統的な漢方薬(TCM)化学の分野で広く使用されています。TCMの化学組成に関する定性的および定量的研究は、医薬品の成分とその関?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、四川省自然科学財団(第2022NSFSC0171号)および成都TCM大学の興林人材プログラム(第030058042号)の支援を受けました。
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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