DESI-MSI를 이용한 중국 전통 의학의 공간 대사체에서 확인된 대사산물의 시각화
Summary
본 연구에서는 플랜트에서 DESI-MSI 샘플을 준비하기 위한 일련의 방법을 제시하고, DESI 어셈블리 설치, MSI 데이터 수집 및 처리 절차를 상세히 설명한다. 이 프로토콜은 식물에서 공간 대사체 정보를 획득하기 위한 여러 조건에 적용될 수 있습니다.
Abstract
중국 전통 의학의 의약 사용은 주로 2 차 대사 산물 때문입니다. 이러한 대사 산물의 분포를 시각화하는 것은 식물 과학에서 중요한 주제가 되었습니다. 질량 분석 이미징은 조직 조각을 분석하여 방대한 양의 데이터를 추출하고 이에 대한 공간 분포 정보를 제공할 수 있습니다. 높은 처리량과 더 높은 정확도의 장점으로 탈착 전기분무 이온화 질량 분석 이미징(DESI-MSI)은 생물학 연구 및 중국 전통 의학 연구에 자주 사용됩니다. 그러나 이 연구에 사용된 절차는 복잡하고 저렴하지 않습니다. 이 연구에서 우리는 절편 및 DESI 이미징 절차를 최적화하고 특히 중국 전통 의약품에 중점을 두고 대사 산물의 분포를 식별하고 식물 조직에서 이러한 화합물을 분류하는 보다 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 이 연구는 연구 관련 기술을 위한 중국 전통 의학/민족 의학의 대사 산물 분석 및 표준화에서 DESI의 활용을 촉진할 것입니다.
Introduction
대사 산물 분포의 시각화는 식물 내 특정 대사 산물의 형성 과정을 공개하기 때문에 식물 과학, 특히 중국 전통 의학에서 중요한 주제가 되었습니다. 중국 전통 의학(TCM)과 관련하여 활성 성분에 대한 정보를 제공하고 제약 응용 분야에서 식물 부분의 적용을 안내합니다. 일반적으로 대사 산물의 시각화는 현장 혼성화, 형광 현미경 또는 면역조직화학에 의해 이루어지지만 이러한 실험에서 검출된 화합물의 수는 제한된 화학 정보를 전달합니다. 조직 염색과 결합된 질량 분석 이미징(MSI)은 미크론 수준1에서 조직 조각을 스캔하고 분석하여 많은 양의 데이터를 제공하고 화합물의 공간 분포 정보를 제공할 수 있습니다. MSI는 시료 표면에서 탈착 및 이온화를 위해 분석물을 사용하고, 생성된 증기상 이온의 질량 분석과 이미징 소프트웨어를 적용하여 정보를 통합하고 특정 이온 존재비를 기록하는 2차원 이미지를 플로팅합니다. 이 기술은 표적 조직 및 기관에서 약물 및 유도 대사 산물의 특성 분포를 검출함으로써 외인성 및 내인성 분자를 모두 결정할 수 있습니다 2,3,4,5.
최근 수십 년 동안 다양한 이미징 MS 양식이 개발되었습니다. 그 중 가장 두드러진 것은 탈착 전기 분무 이온화 기반 MSI (DESI-MSI), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 및 2 차 이온 질량 분석법 (SIMS)입니다.6. DESI-MSI는 대기 작동, 높은 처리량 및 높은 정확도로 인해 생물학 연구에 자주 사용됩니다7. MALDI는 트랜스티레틴 단편을 겐타마이신에 대한 잠재적인 신독성 바이오마커로 식별하고 생쥐 뇌에서 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘을 투여한 후 신경독성 대사산물인 1-메틸-4-페닐피리디늄의 분포를 분석하기 위해 적용되었습니다 8,9. MALDI와 DESI는 투여된 토끼의 신장에서 약물 유도 결정과 같은 구조의 구성을 결정하는 데 사용되었습니다. 이들 구조는 주로 약물(10)의 탈메틸화 및/또는 산화로 인해 형성된 대사산물로 구성된다. 또한 MSI는 표적 기관에서 약물 독성의 대사 분포의 국소화에 적용되었습니다. 그러나 식물 조직의 세포는 다양하고 동물과 다르며 특별한 절개 절차가 필요합니다.
식물에서, MALDI 이미징을 이용하여, 지금까지 밀(Triticum aestivum) 줄기, 콩(Glycine max), 벼(Oryza sativa) 종자, 애기장대 꽃 및 뿌리, 및 보리(Hordeum vulgare) 종자에서 상이한 화합물의 분포가 분석되었다 11,12,13,14,15,16,17,18 . 최근 연구에 따르면 DESI-MSI는 특히 은행나무, Fuzi 및 Artemisia annua L 19,20,21과 같은 TCM에서 천연 약물 및 제품의 대사 산물 분석에서 부상하고 있습니다. 이 연구에서 식물 재료 샘플 준비를위한 프로토콜은 다르며 일부는 냉동 마이크로 톰과 같은 더 복잡한 장비가 필요합니다. DESI-MSI는 검출된 샘플의 표면 평탄도에 대한 엄격한 요구 사항을 가지고 있습니다. 동물의 장기 또는 조직을 분석할 때, 샘플은 보통 냉동절편(cryo-sectioning)에 의해 이루어진다22. 그러나 극저온 절편 절차는 복잡하고 비용이 많이 들며, 일반적으로 사용되는 접착제 최적 절단 온도(OCT) 방법은 이미징 시 신호가 강합니다. 또한 TCM의 의약 조직은 다양합니다. 예를 들어, 중국어로 Danshen으로 알려진 Salvia miltiorrhiza의 뿌리는 약용으로 사용되는 반면 Zisu (Perilla frutescens)에서는 잎이사용됩니다 23,24. 따라서 TCM에 대한 대사산물 분석에서 DESI의 활용을 촉진하기 위해 샘플 준비 절차를 개선할 필요가 있습니다.
다년생 초본이자 일반적으로 사용되는 TCM인 S. miltiorrhiza 는 처음에 가장 오래된 의학 논문인 Shennong’s Classic of Materia Medica(중국어로 Shennong Bencao Jing으로 알려짐)에 기록되었습니다. 이 연구에서 우리는 절편 및 DESI 이미징 절차를 최적화하고 분포를 식별하고 S. miltiorrhiza의 조직에서 화합물을 분류하는 보다 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 이 방법은 또한 건조 조직과 관련된 단점을 극복 할 수 있습니다 – 일반적으로 질소 블로우에 의해 쉽게 파괴됩니다 – TCM의 발달을 촉진합니다. 이 연구는 연구 관련 기술에 대한 TCM/민족 의학의 표준화를 촉진할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MS 기술의 출현은 최근 몇 년 동안 분자 수준에서 천연물 연구에 대한 새로운 통찰력을 열었습니다24. 고감도 및 높은 처리량을 갖춘 MS 기기는 미량 농도25에서도 천연물 내 대사산물의 표적 및 비표적 분석을 가능하게 합니다. 따라서 MS는 현재 중국 전통 의학(TCM) 화학 분야에서 널리 사용됩니다. TCM의 화학 성분에 대한 질적 및 정량적 연구는 약리학 연구에 적?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 쓰촨성 자연과학재단(No. 2022NSFSC0171)과 청두대학교 한의학대학(No. 030058042)의 Xinglin Talent Program의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
Riferimenti
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
- Qiu, Z. -. D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
- Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
- Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
- Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
- Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
- Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
- Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
- Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
- Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
- Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
- Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
- Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
- Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
- Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
- Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
- Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
- Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
- Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
- Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
- Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
- Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
- Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
- Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
- Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
- Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
- Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
- Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
- Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
- Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
- Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).
