Visualisering av metabolitter identifisert i det romlige metabolomet av tradisjonell kinesisk medisin ved bruk av DESI-MSI

Summary

I denne studien presenteres en rekke metoder for å forberede DESI-MSI-prøver fra planter, og en prosedyre for DESI-monteringsinstallasjon, MSI-datainnsamling og prosessering er beskrevet i detalj. Denne protokollen kan brukes under flere forhold for å skaffe romlig metabolominformasjon i planter.

Abstract

Den medisinske bruken av tradisjonell kinesisk medisin skyldes hovedsakelig dets sekundære metabolitter. Visualisering av fordelingen av disse metabolittene har blitt et viktig tema i plantevitenskapen. Massespektrometriavbildning kan trekke ut store mengder data og gi romlig fordelingsinformasjon om disse ved å analysere vevsskiver. Med fordelen av høy gjennomstrømning og høyere nøyaktighet, brukes desorpsjonselektrosprayionisering massespektrometriavbildning (DESI-MSI) ofte i biologisk forskning og i studiet av tradisjonell kinesisk medisin. Prosedyrene som brukes i denne undersøkelsen er imidlertid kompliserte og ikke rimelige. I denne studien optimaliserte vi seksjonerings- og DESI-bildebehandlingsprosedyrer og utviklet en mer kostnadseffektiv metode for å identifisere fordelingen av metabolitter og kategorisere disse forbindelsene i plantevev, med et spesielt fokus på tradisjonelle kinesiske medisiner. Studien vil fremme bruken av DESI i metabolittanalyse og standardisering av tradisjonell kinesisk medisin / etnisk medisin for forskningsrelaterte teknologier.

Introduction

Visualisering av metabolittfordeling har blitt et viktig tema i plantevitenskap, spesielt i tradisjonell kinesisk medisin, da det avslører dannelsesprosessen av spesifikke metabolitter i planten. Med henvisning til tradisjonell kinesisk medisin (TCM), gir den informasjon om de aktive komponentene og veileder anvendelsen av plantedeler i farmasøytiske applikasjoner. Normalt oppnås visualisering av metabolitter ved in situ hybridisering, fluorescensmikroskopi eller immunhistokjemi, men antall forbindelser detektert av disse forsøkene formidler begrenset kjemisk informasjon. Kombinert med vevsfarging kan massespektrometriavbildning (MSI) gi store mengder data og gi romlig fordelingsinformasjon av forbindelser ved å skanne og analysere vevsskiver på mikronnivå¹. MSI bruker analytter for desorpsjon og ionisering fra prøveoverflaten, etterfulgt av masseanalyse av de resulterende dampfaseioner og anvendelse av bildebehandlingsprogramvare for å integrere informasjonen og plotte et todimensjonalt bilde som registrerer en spesifikk ionoverflod. Denne teknologien kan bestemme både eksogene og endogene molekyler ved å oppdage den karakteristiske fordelingen av legemidler og deres induserte metabolitter i målvev og organer 2,3,4,5.

Ulike bildebehandlingsmodaliteter har blitt utviklet de siste tiårene; De mest fremtredende blant dem er desorpsjonselektrosprayioniseringsbasert MSI (DESI-MSI), matriseassistert laserdesorpsjon/ionisering (MALDI) og sekundær ionmassespektrometri (SIMS)⁶. DESI-MSI brukes ofte i biologisk forskning på grunn av sin atmosfæriske drift, høye gjennomstrømning og høyere nøyaktighet⁷. MALDI har blitt brukt til å identifisere et transtyretinfragment som en potensiell nefrotoksisk biomarkør for gentamicin og for å analysere fordelingen av den nevrotoksiske metabolitten 1-metyl-4-fenylpyridinium etter styring av 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin i mushjerner ^8,9. MALDI og DESI har blitt brukt til å bestemme sammensetningen av legemiddelinduserte krystalllignende strukturer i nyrene til doserte kaniner; Disse strukturene består hovedsakelig av metabolitter dannet på grunn av demetylering og/eller oksidasjon av legemidlet¹⁰. I tillegg har MSI blitt brukt i lokalisering av metabolsk distribusjon av legemiddeltoksisitet i målorganer. Cellene i plantevev varierer imidlertid og er forskjellige fra dyr og krever spesielle seksjoneringsprosedyrer.

I planter, ved hjelp av MALDI imaging, så langt, har fordelingen av forskjellige forbindelser i hvete (Triticum aestivum) stamme, soyabønne (Glycine max), ris (Oryza sativa) frø, Arabidopsis thaliana blomster og røtter, og bygg (Hordeum vulgare) frø blitt analysert 11,12,13,14,15,16,17,18 . Nylige studier har rapportert at DESI-MSI dukker opp i metabolittanalysen av naturlige legemidler og produkter, spesielt i TCM som Ginkgo biloba, Fuzi og Artemisia annua L 19,20,21. I disse studiene er protokollene for fremstilling av plantematerialprøver forskjellige, og noen krever mer komplekst utstyr, som en frysende mikrotom. DESI-MSI har strenge krav til overflateflatheten til den påviste prøven. Ved analyse av organ eller vev av et dyr, blir prøven vanligvis laget ved kryo-seksjonering²². Prosedyren for kryosnitting er imidlertid komplisert og dyrere, og den vanlige metoden for optimal skjæretemperatur (OCT) har et sterkt signal ved avbildning. I tillegg varierer det medisinske vevet i TCM; for eksempel brukes roten til Salvia miltiorrhiza, kjent som Danshen på kinesisk, mens i Zisu (Perilla frutescens) brukes bladet^23,24. Derfor er det nødvendig å forbedre prøveprepareringsprosedyrene for å fremme bruken av DESI i metabolittanalyse for TCM.

Som en flerårig urt og en vanlig brukt TCM, ble S. miltiorrhiza opprinnelig registrert i den eldste medisinmonografien, Shennong’s Classic of Materia Medica (kjent som Shennong Bencao Jing på kinesisk). I denne studien optimaliserte vi seksjonerings- og DESI-bildebehandlingsprosedyrer og utviklet en mer kostnadseffektiv metode for å identifisere fordelingen og kategorisere forbindelsene i vev av S. miltiorrhiza. Denne metoden kan også overvinne ulempene forbundet med tørt vev – at de vanligvis lett sprekker under nitrogenblåsingen – og fremmer utviklingen av TCM. Studien vil fremme standardisering av TCM / etnisk medisin for forskningsrelaterte teknologier.

Protocol

1. Forberedelse av prøver Samle rensede røtter og blader fra en 2 år gammel Salvia miltiorrhiza-plante (figur 1A), og skjær direkte i en tverrsnittstykkelse på ca. 3-5 mm for hånd. Deretter fester du prøven på et adhesjonsmikroskopglassglass ved hjelp av dobbeltsidig tape (figur 1B).MERK: Kontroller at størrelsen på dobbeltsidig tape er større enn prøven. Hvis vevet er tørket, suge dem i vann eller 4% paraform…

Representative Results

Denne protokollen kan føre til identifisering og distribusjon av forbindelser i planteprøver. I MS-bildet av en bestemt m / z representerer fargen på hver enkelt piksel den relative intensiteten til m / z, og kan dermed knyttes til den naturlige fordelingen og overflod av metabolittionet gjennom hele prøven. Jo høyere overflod av kjemikaliet ved oppsamlingsposisjonen, desto lysere er fargen. Linjen på bildet (figur 4A-D) viser fargenes gradient. Her va…

Discussion

Fremveksten av MS-teknologi har åpnet en ny innsikt i naturproduktforskning på molekylært nivå de siste årene²⁴. MS-instrumentet, med sin høye følsomhet og høye gjennomstrømning, muliggjør målrettet og ikke-målrettet analyse av metabolitter i naturlige produkter, selv med sporkonsentrasjon²⁵. Derfor er MS for tiden mye brukt innen tradisjonell kinesisk medisin (TCM) kjemi. Den kvalitative og kvantitative forskningen på den kjemiske sammensetningen av TCM kan gi…

Materials

2-Propanol	Fisher	CAS:67-63-0	HPLC grade
Acetonitrile	Sigma-aldrich	Number-75-05-8	LC-MS grade
Adhesion Microscope slides	Citotest scientific	80312-3161	Microscope glass slides  can adhere to  the sample
Air cooled dry vacuum pump	EYELA	FDU-2110	Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid	ACS	F1089 | 64-18-6	LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)	Waters	186006013-1	LC-MS grade
Methanol	Sigma-aldrich	Number-67-56-1	LC-MS grade
Parafilm	Bemis Company	sc-200288	Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	V900894	Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source	Waters	Synapt XS