JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Geleneksel Çin Tıbbının Mekansal Metabolomunda Tanımlanan Metabolitlerin DESI-MSI Kullanılarak Görselleştirilmesi

Published: December 16, 2022
doi:
10.3791/64912
, , , , ,
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Tianfu Chinese Medicine Innovation Harbour,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical Technology,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4China Resources Sanjiu (Ya’an) Pharmaceutical Co., Ltd.

Summary

Bu çalışmada, bitkilerden DESI-MSI örnekleri hazırlamak için bir dizi yöntem sunulmuş ve DESI montaj kurulumu, MSI veri toplama ve işleme prosedürü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokol, bitkilerde uzamsal metabolom bilgisi elde etmek için çeşitli koşullarda uygulanabilir.

Abstract

Geleneksel Çin tıbbının tıbbi kullanımı esas olarak ikincil metabolitlerinden kaynaklanmaktadır. Bu metabolitlerin dağılımının görselleştirilmesi, bitki biliminde çok önemli bir konu haline gelmiştir. Kütle spektrometresi görüntüleme, büyük miktarda veri çıkarabilir ve doku dilimlerini analiz ederek bunlar hakkında mekansal dağılım bilgileri sağlayabilir. Yüksek verim ve daha yüksek doğruluk avantajıyla, desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi görüntüleme (DESI-MSI) genellikle biyolojik araştırmalarda ve geleneksel Çin tıbbı çalışmalarında kullanılır. Bununla birlikte, bu araştırmada kullanılan prosedürler karmaşıktır ve uygun değildir. Bu çalışmada, kesitleme ve DESI görüntüleme prosedürlerini optimize ettik ve geleneksel Çin ilaçlarına özel olarak odaklanarak metabolitlerin dağılımını tanımlamak ve bu bileşikleri bitki dokularında kategorize etmek için daha uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Çalışma, DESI’nin metabolit analizinde ve geleneksel Çin tıbbı / etnik tıbbının araştırmayla ilgili teknolojiler için standardizasyonunda kullanılmasını teşvik edecektir.

Introduction

Metabolit dağılımının görselleştirilmesi, bitki biliminde, özellikle geleneksel Çin tıbbında, bitki içindeki spesifik metabolitlerin oluşum sürecini ortaya çıkardığı için çok önemli bir konu haline gelmiştir. Geleneksel Çin tıbbına (TCM) atıfta bulunarak, aktif bileşenler hakkında bilgi sağlar ve farmasötik uygulamalarda bitki parçalarının uygulanmasına rehberlik eder. Normalde, metabolitlerin görselleştirilmesi in situ hibridizasyon, floresan mikroskobu veya immünohistokimya ile sağlanır, ancak bu deneylerle tespit edilen bileşiklerin sayısı sınırlı kimyasal bilgi iletir. Doku boyama ile birlikte, kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI), mikron düzeyinde1’de doku dilimlerini tarayarak ve analiz ederek büyük miktarda veri sağlayabilir ve bileşiklerin uzamsal dağılım bilgilerini sağlayabilir. MSI, numune yüzeyinden desorpsiyon ve iyonizasyon için analitler kullanır, ardından ortaya çıkan buhar fazı iyonlarının kütle analizi ve bilgiyi entegre etmek ve belirli bir iyon bolluğunu kaydeden iki boyutlu bir görüntü çizmek için görüntüleme yazılımının uygulanması takip eder. Bu teknoloji, ilaçların karakteristik dağılımını ve bunların indüklediği metabolitleri hedef doku ve organlarda tespit ederek hem eksojen hem de endojen molekülleri belirleyebilir 2,3,4,5.

Son yıllarda çeşitli görüntüleme MS modaliteleri geliştirilmiştir; bunların arasında en belirgin olanları desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon bazlı MSI (DESI-MSI), matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) ve ikincil iyon kütle spektrometrisidir (SIMS)6. DESI-MSI, atmosferik çalışması, yüksek verimi ve daha yüksek doğruluğu nedeniyle biyolojik araştırmalarda sıklıkla kullanılır7. MALDI, gentamisin için potansiyel bir nefrotoksik biyobelirteç olarak bir transtiretin fragmanını tanımlamak ve farelerin beyinlerinde 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin yönetiminden sonra nörotoksik metabolit 1-metil-4-fenilpiridinyumun dağılımını analiz etmek için uygulanmıştır 8,9. MALDI ve DESI, dozlanmış tavşanların böbreğinde ilaca bağlı kristal benzeri yapıların bileşimini belirlemek için kullanılmıştır; Bu yapılar esas olarak ilacın10’unun demetilasyonu ve / veya oksidasyonu nedeniyle oluşan metabolitlerden oluşur. Ek olarak, MSI, hedef organlarda ilaç toksisitesinin metabolik dağılımının lokalizasyonunda uygulanmaktadır. Bununla birlikte, bitki dokusundaki hücreler değişir ve hayvanlardan farklıdır ve özel bölümleme prosedürleri gerektirir.

Bitkilerde, MALDI görüntüleme kullanılarak, şimdiye kadar, buğday (Triticum aestivum) sapı, soya fasulyesi (Glycine max), pirinç (Oryza sativa) tohumları, Arabidopsis thaliana çiçekleri ve kökleri ile arpa (Hordeum vulgare) tohumlarındaki farklı bileşiklerin dağılımı analiz edilmiştir 11,12,13,14,15,16,17,18 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, DESI-MSI’nin doğal ilaçların ve ürünlerin metabolit analizinde, özellikle Ginkgo biloba, Fuzi ve Artemisia annua L 19,20,21 gibi TCM’lerde ortaya çıktığını bildirmiştir. Bu çalışmalarda, bitki materyali örneklerinin hazırlanması için protokoller farklıdır ve bazıları dondurucu bir mikrotom gibi daha karmaşık ekipmanlar gerektirir. DESI-MSI, tespit edilen numunenin yüzey düzgünlüğü için katı gereksinimlere sahiptir. Bir hayvanın organını veya dokusunu analiz ederken, numune genellikle kriyo-kesit22 ile yapılır. Bununla birlikte, kriyo-kesitleme prosedürü karmaşık ve daha pahalıdır ve yaygın olarak kullanılan yapışkan optimal kesme sıcaklığı (OCT) yöntemi, görüntüleme sırasında güçlü bir sinyale sahiptir. Ek olarak, TCM’nin tıbbi dokuları değişir; Örneğin, Çince’de Danshen olarak bilinen Salvia miltiorrhiza’nın kökü tıbbi olarak kullanılırken, Zisu’da (Perilla frutescens) yaprak23,24 kullanılır. Bu nedenle, TCM için metabolit analizinde DESI kullanımını teşvik etmek için numune hazırlama prosedürlerinin iyileştirilmesi gerekmektedir.

Çok yıllık bir bitki ve yaygın olarak kullanılan bir TCM olarak, S. miltiorrhiza başlangıçta en eski tıp monografisinde, Shennong’un Materia Medica’nın Klasiği’nde (Çince’de Shennong Bencao Jing olarak bilinir) kaydedildi. Bu çalışmada, kesitleme ve DESI görüntüleme prosedürlerini optimize ettik ve S. miltiorrhiza’nın dokularındaki bileşiklerin dağılımını tanımlamak ve kategorize etmek için daha uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem aynı zamanda kuru dokularla ilişkili dezavantajların üstesinden gelebilir – genellikle azot darbesi altında kolayca kırılırlar – ve TCM’nin gelişimini teşvik eder. Çalışma, araştırma ile ilgili teknolojiler için TCM / etnik tıbbın standardizasyonunu teşvik edecektir.

Protocol

1. Numune hazırlama 2 yaşındaki bir Salvia miltiorrhiza bitkisinden temizlenmiş kökleri ve yaprakları toplayın (Şekil 1A) ve elle yaklaşık 3-5 mm’lik bir kesit kalınlığında doğrudan dilimleyin. Ardından, numuneyi çift taraflı bant kullanarak bir yapışma mikroskobu cam slaydına yapıştırın (Şekil 1B).NOT: Çift taraflı bandın boyutunun numuneden daha büyük olduğundan emin olun. Dokular kurutulu…

Representative Results

Bu protokol, bitki örneklerinde bileşiklerin tanımlanmasına ve dağıtılmasına yol açabilir. Belirli bir m / z’nin MS görüntüsünde, her bir pikselin rengi, m / z’nin göreceli yoğunluğunu temsil eder, böylece numune boyunca metabolit iyonunun doğal dağılımı ve bolluğu ile ilişkilendirilebilir. Kimyasalın toplama pozisyonundaki bolluğu ne kadar yüksek olursa, renk o kadar parlak olur. Resimdeki çubuk (Şekil 4A-D) renklerin gradyanın…

Discussion

MS teknolojisinin ortaya çıkışı, son yıllarda moleküler düzeyde doğal ürün araştırmalarında yeni bir bakış açısı açmıştır24. MS cihazı, yüksek hassasiyeti ve yüksek verimi ile, eser konsantrasyonda bile doğal ürünlerdeki metabolitlerin hedefli ve hedefsiz analizini sağlar25. Bu nedenle, MS şu anda geleneksel Çin tıbbı (TCM) kimyası alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. TCM’nin kimyasal bileşimi üzerine yapılan nitel ve nicel ara?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Sichuan eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2022NSFSC0171) ve TCM Chengdu Üniversitesi Xinglin Yetenek Programı (No. 030058042) tarafından desteklenmiştir.

Materials

2-Propanol Fisher CAS:67-63-0 HPLC grade
Acetonitrile Sigma-aldrich Number-75-05-8 LC-MS grade
Adhesion Microscope slides Citotest scientific 80312-3161 Microscope glass slides  can adhere to  the sample 
Air cooled dry vacuum pump EYELA FDU-2110 Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid ACS F1089 | 64-18-6 LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin) Waters 186006013-1 LC-MS grade
Methanol Sigma-aldrich Number-67-56-1 LC-MS grade
Parafilm  Bemis Company sc-200288 Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde Sigma-aldrich V900894 Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source Waters Synapt XS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
  3. Qiu, Z. -. D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
  4. Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
  5. Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
  6. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
  7. Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
  8. Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
  9. Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
  10. Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
  11. Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
  12. Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
  13. Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
  14. Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
  15. Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
  16. Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
  17. Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
  18. Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
  19. Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
  20. Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
  21. Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
  22. Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
  23. Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
  24. Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
  25. Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
  26. Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
  27. Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
  28. Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
  29. Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
  30. Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
  31. Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
  32. Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  33. Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
  34. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  35. Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).

Tags

Spatial MetabolomicsDESI-MSIPlant Sample PreparationCryosectioningImprintingSalvia MiltiorrhizaSample FreezingVacuum DryingMatrix ApplicationESI ModeDESI Unit SetupSolvent Ionization
check_url/it/64912?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Xu, B., Chen, L., Lv, F., Pan, Y., Fu, X., Pei, Z. Visualization of Metabolites Identified in the Spatial Metabolome of Traditional Chinese Medicine Using DESI-MSI. J. Vis. Exp. (190), e64912, doi:10.3791/64912 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image