Præsenteret her er en flowcytometribaseret teknik, der giver mulighed for samtidig måling af antallet af celledelinger, overfladecellefænotype og cellulært slægtskab. Disse egenskaber kan testes statistisk ved hjælp af en permutationsbaseret ramme.
Få teknikker kan vurdere fænotype og skæbne for den samme celle samtidigt. De fleste af de nuværende protokoller, der bruges til at karakterisere fænotype, selvom de er i stand til at generere store datasæt, nødvendiggør ødelæggelsen af cellen af interesse, hvilket gør det umuligt at vurdere dens funktionelle skæbne. Heterogene biologiske differentierende systemer som hæmatopoiesis er derfor vanskelige at beskrive. Med udgangspunkt i celledelingssporingsfarvestoffer videreudviklede vi en protokol til samtidig bestemmelse af slægtskab, divisionsnummer og differentieringsstatus for mange enkelte hæmatopoietiske forfædre. Denne protokol gør det muligt at vurdere ex vivo-differentieringspotentialet hos murine og humane hæmatopoietiske forfædre, isoleret fra forskellige biologiske kilder. Da det desuden er baseret på flowcytometri og et begrænset antal reagenser, kan det hurtigt generere en stor mængde data på enkeltcelleniveau på en relativt billig måde. Vi leverer også den analytiske pipeline til enkeltcelleanalyse kombineret med en robust statistisk ramme. Da denne protokol tillader sammenkædning af celledeling og differentiering på enkeltcelleniveau, kan den bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner for en given forpligtelsesskæbne. Alt i alt kan denne protokol bruges i eksperimentelle designs, der sigter mod at optrævle de biologiske forskelle mellem hæmatopoietiske forfædre fra et enkeltcelleperspektiv.
Det sidste årti var præget af den verdensomspændende spredning af enkeltcellede tilgange til cellulær og molekylærbiologi. Efter at have fulgt trinene i enkeltcellegenomik1,2 er det i dag muligt at studere mange komponenter i en enkelt celle (f.eks. DNA, RNA, proteiner), med nye enkeltcelle-omics-teknikker, der spirer hvert år. Disse teknikker har kastet lys over gamle og nye spørgsmål inden for immunologi, neurobiologi, onkologi og andre, både ved hjælp af humane og modelorganismeceller3. Ved at fremhæve forskellene mellem individuelle celler foranledigede enkeltcelle-omics definitionen af en ny model af hæmatopoiesis, centreret om heterogeniteten af hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC’er) og bevægede sig væk fra den klassiske model af diskrete homogene populationer 4,5.
En af de få ulemper ved alle -omics-teknikkerne er ødelæggelsen af den relevante celle, hvilket udelukker muligheden for at vurdere dens funktionalitet. Omvendt giver andre enkeltcellemetoder, såsom enkeltcelletransplantationsanalyse og afstamningssporingsteknologier, en aflæsning af forfadercellens funktionalitet ved at vurdere individuelle cellers skæbne in vivo 6,7. Afstamningssporingsteknologier involverer mærkning af den interessante celle med en arvelig genetisk7 eller en fluorescerende etiket8,9, hvilket gør det muligt at følge skæbnen for flere enkeltceller på samme tid. Imidlertid er karakteriseringen af startcellerne typisk begrænset til et begrænset antal parametre, såsom ekspressionen af nogle få overfladeproteiner vurderet ved flowcytometri10. Derudover kræver enkeltcelle afstamningssporingsteknologier besværlig detektion af den cellulære etiket, typisk via DNA / RNA-sekventering eller billeddannelse. Dette sidste punkt begrænser især antallet af forhold, der kan testes i et enkelt eksperiment.
En anden klasse af metoder, der bruges til at studere funktionaliteten af enkeltceller, er ex vivo-celledyrkningssystemer af enkelte HSPC’er. Disse guldstandardassays er nemme at udføre og involverer sortering af individuelle celler i cellekulturbeholdere med 96 brønde og efter dyrkning karakteriserer celleafkomfænotypen, typisk ved flowcytometri eller morfologisk analyse. Disse analyser er for det meste blevet brugt til at karakterisere den langsigtede differentiering af HSPC’er i modne celler, typisk efter 2-3 ugers dyrkning 11,12. Alternativt er de blevet brugt til at forsøge at opretholde og udvide ex vivo HSPC’er 13,14,15,16,17,18 med løftet om medicinsk fordel ved transplantation af humane stamceller 19. Endelig er de blevet brugt til at studere HSPC’ers tidlige engagement ved hjælp af kortvarig kultur20, hvor det lave antal celler, der genereres i denne kultur, er den vigtigste begrænsende faktor. En ulempe ved disse forskellige former for ex vivo-assays er, at de kun delvist afspejler di vivo-kompleksiteten; Alligevel er de en af de sjældne måder at studere menneskelig HSPC-differentiering på.
Et manglende stykke information fra eksisterende enkeltcellemetoder (enkeltcelle-omics, afstamningssporing og ex vivo-kultur) er den nøjagtige detektion af celledelinger, en vigtig parameter at overveje, når man studerer HSPC-dynamik21. En enkel måde at vurdere antallet af divisioner via flowcytometri er brugen af opløselige “proteinfarvestoffer”, som 5-(og 6)-carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE)22. Disse divisionsfarvestoffer diffunderer inde i cytoplasmaet i de farvede celler og fortyndes med halvdelen og overføres til de to datterceller ved hver celledeling, hvilket gør det muligt at opregne op til 10 divisioner. Ved at kombinere flere divisionsfarvestoffer er det muligt at frø flere individuelle forfædre i samme brønd, da hvert enkelt farvestof tillader adskillelse af de forskellige efterkommere. Dette er princippet bag brugen af cellefarvestoffer til multiplex klonal og divisionssporing, der først blev introduceret for murine lymfocytter23,24.
Her præsenterer vi udviklingen af MultiGen-analysen til brug med murin og humane HSPC’er. Det tillader test af mange enkeltceller samtidigt for deres egenskaber ved differentiering, opdeling og slægtskab ex vivo. Denne høje gennemstrømning, let at udføre og billig analyse gør det muligt at måle den cellulære fænotype, antallet af udførte divisioner og celleslægtskabet og klonforholdet med de andre celler i brønden, alt sammen på samme tid. Det kan bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner, der er nødvendige for en given forpligtelsesskæbne. Protokollen kræver en fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og et flowcytometer med en pladelæser plus det nødvendige udstyr til at udføre cellekultur. Ud over den tekniske protokol til udførelse af analysen på humane HSPC’er leverer vi også den detaljerede analyseramme, herunder den statistiske test, der er nødvendig for at vurdere cellulære egenskaber relateret til begrebet cellefamilie25. Denne protokol er allerede blevet brugt med succes til at beskrive murine HSPC-rummet26,27.
Følgende protokol bruger magnetisk berigede CD34+-celler som udgangsmateriale28. På denne måde er det muligt effektivt at plette og isolere de humane HSPC’er fra forskellige blodkilder (f.eks. Navlestrengsblod, knoglemarv, perifert blod). Det er vigtigt ikke at kassere CD34-fraktionen, da den vil blive brugt som en del af protokollen til at indstille forskellige typer eksperimentelle kontroller. De nævnte cellemængder og volumener kan skaleres op eller ned i henhold til den eksperimentelle arbejdsgang og fornødenheder. På samme måde kan protokollen tilpasses undersøgelsen af forskellige typer forfædre, blot ved at ændre de antistoffer, der anvendes til cellesortering og flowcytometritrin.
MultiGen-analysen er et højt gennemløb, let at udføre og billigt assay, der har været medvirkende til at studere lymfocyt 23,24,35 og murin hæmatopoietiske celler 26,27. Her præsenterer vi en ny udvikling af tilgangen, der gør det muligt ex vivo at dechiffrere den tidlige fase af menneskelig HSPC-forpligtelse på enkeltcelleniveau ved hjælp af kortvarig kultur (figur 6). Enkeltcelle ex vivo-kultursystemer bruges typisk til at vurdere HSPC’ernes langsigtede skæbne i modne celler, men nogle skæbner forekommer tidligere end andre36, hvilket potentielt fordrejer analysen mod færre skæbner. Derudover savner disse kultursystemer normalt information om opdelinger under skæbneforpligtelse. De første forpligtelsestrin har vist sig at forekomme så tidligt som i starten af kulturen, nogle gange uden division26,37, hvilket gør kortsigtet kultur og sporingsopdeling afgørende for at studere tidlig skæbneforpligtelse. Ved samtidig at følge skæbnen, opdelingen og slægtskabet giver dette assay mulighed for at forstå rollen som den første division og skæbnebeslutningen i humane HSPC’er. Ved hjælp af analysen er det muligt at udlede, efter hvor mange opdelinger forpligtelsesprocessen finder sted, balancen mellem selvfornyelse og differentiering for de tidlige forfædre, og hvordan disse egenskaber arves på tværs af generationer. Så vidt vi ved, er dette det eneste assay, der tillader disse typer målinger for humane HSPC’er ved enkeltcelleopløsning. Derudover øgede vi analysens gennemløb ved hjælp af forskellige kombinationer af celledelingsfarvestoffer, hvilket gør dette assay til et værdifuldt værktøj til hurtigt at generere store datasæt. Farvekombinationerne gør det muligt at følge flere familier i de samme brønde, hvilket øger antallet af celler, der er tilgængelige til analyse i kortvarig kultur. Antallet af kombinationer kan potentielt øges endnu mere ved tilsætning af andre farvestoffer (f.eks. gult farvestof) eller ændring af forholdet mellem CFSE og CTV. Dette reducerer dog antallet af andre parametre, der kan analyseres.
Figur 6: Skematisk gengivelse af protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at udføre analysen med succes er det på grund af det store antal brønde og det reducerede antal celler, der skal analyseres, nødvendigt at køre flowcytometrianalysen på en analysator udstyret med en pladelæser. Den nye generation af bænkanalysatorer er specielt tilpasset dette assay, da de fleste af dem har et mindre dødvolumen for at reducere procentdelen af celletab. Dette garanterer igen en højere effektivitet ved genvinding af hele hver brønd, hvilket giver anledning til en effektivitet, der anslås til 70% -området26. Estimering af celletabet under flowcytometrioptagelsen er afgørende for analysen af hver enkelt familie. For eksempel, forudsat at der ikke er celledød og tæller antallet af divisioner, er det muligt at estimere antallet af celler pr. Hver familie. Ikke desto mindre er det ønskeligt at gennemføre nogle konfirmatoriske forsøg, især i estimering af celledød under de testede dyrkningsbetingelser og måling af genfindingshastigheden eksperimentelt ved hjælp af et defineret antal celler.
Et af de afgørende trin i denne protokol er toptildelingen. Som allerede nævnt er en topfordeling af god kvalitet stærkt afhængig af isoleringen af meget smalle toppe ved cellesortering. Ikke desto mindre er det stadig vanskeligt at tildele det korrekte antal divisioner baseret entydigt på fordelingen. Da cellesortering og flowcytometrianalyse udføres på to forskellige maskiner, er det ikke muligt direkte at sammenligne intensiteten af hvert signal, så det kan være svært at vide, om den første top, der observeres i højre ende af histogrammet, er top 0 eller top 1. I denne henseende er få løsninger mulige; En måde er at udføre et ortogonalt eksperiment for nøjagtigt at måle antallet af divisioner udført af disse celler (f.eks. Levende cellebilleddannelse). En anden mulighed er blot at tælle antallet af celler i brønden under et omvendt brightfield-mikroskop, før flowcytometrianalysen køres. Dette vil udlede et gennemsnitligt antal divisioner (forudsat at der ikke er celledød). Endelig er en post-hoc løsning til spidsbelastning påvisning af et usædvanligt antal “umulige familier”; Disse familier består af et større antal celler end muligt pr. generation (f.eks. fem celler i generation 2 eller to celler i generation 1 og en celle i generation 2). Muligheden for at udelukke umulige familier kodes i det statistiske analysetrin og markerer den umulige familie. Hvis forekomsten af disse fejl er for høj, er det rimeligt at antage, at spidsbelastningstildelingen skal revideres.
I denne protokol inkluderede vi et par eksempler på datarepræsentation og analyse til analysen, da dette er blevet et vigtigt skridt i genereringen og fortolkningen af store datasæt38. Det første eksempel er varmekortet, der viser totaliteten af alle analyserede celler, organiseret pr. Familie. Dette er et effektivt værktøj til at udforske de generelle egenskaber ved dataene og potentielle konklusioner: er familier sammensat af flere celletyper, eller har de tendens til at være homogene i sammensætning? Er familier spredt over flere generationer, eller deler de for det meste det samme antal gange? Denne sonderende analyse skal derefter suppleres med mere specifikke observationsområder og statistiske undersøgelser. Det kan bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, differentiering uden division, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner for en given forpligtelsesskæbne. Det er grundlæggende under den eksperimentelle planlægning at indstille cellekulturlængden i overensstemmelse hermed til den type spørgsmål, der stilles; For eksempel for de to første spørgsmål (symmetrisk/asymmetrisk balance og differentiering uden division) tillader planlægning af meget korte kulturtrin isolering af et stort antal familier, der kun har udført en eller ingen opdelinger overhovedet26. Omvendt tillader længere eksperimenter udforskning af antallet af divisioner, der kræves for en bestemt celleforpligtelse, da de prøver familier på forskellige stadier af differentiering. Ikke desto mindre er denne metode ikke designet til langsigtede kulturer (2-3 uger), da cellefarvestoffortynding ikke er i stand til nøjagtigt at spore mere end syv eller otte divisioner22. Som følge heraf er dette værktøj for det meste tilpasset til at studere den tidlige forpligtelse hos hæmatopoietiske forfædre og er ikke designet til at drage robuste konklusioner om disse cellers langsigtede differentieringsegenskaber.
Den statistiske ramme blev udviklet specielt til analyse af denne type data og baseret på begrebet permutationer26. Dette var nødvendigt på grund af observationen af en familiær afhængighed af celletypefordelingen og antallet af udførte divisioner. Med andre ord er celler, der er en del af den samme familie, også mere tilbøjelige til at vise lignende fænotyper og opdele det samme antal gange. Selv om en tilbundsgående analyse ligger uden for rammerne af dette arbejde, bør det leverede sæt statistiske test være tilstrækkeligt til vurdering af forskellige forhold.
Afslutningsvis udgør denne protokol et værdifuldt værktøj til vurdering af den cellulære dynamik i hæmatopoietiske stamceller og stamceller ex vivo på en hurtig og billig måde. På grund af sin fleksibilitet og alsidighed med hensyn til tidspunkt, kulturbetingelser og type analyserede HSPC’er giver det mulighed for at teste en række eksperimentelle forhold. Som et flowcytometribaseret assay kan det implementeres i de fleste laboratorier, og det kræver ikke omfattende forudgående viden, hvilket gør det til en god kandidat til screeninger og pilotforsøg.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af Institut Curie Flow Facility for deres hjælp med at oprette flowcytometrieksperimenterne. Vi vil også gerne anerkende bidragene fra de andre medlemmer af Team Perié under flere diskussioner. Vi takker Dr. Julia Marchingo og Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) for at dele deres protokol for multiplexing af celledelingsfarvestoffer på lymfocytter. Vi takker Saint Louis hospitals navlestrengsblodbiobank for at have tilvejebragt de biologiske ressourcer, der er nødvendige for udviklingen af denne protokol. Undersøgelsen blev støttet af et ATIP-Avenir-tilskud fra CNRS og Bettencourt-Schueller Foundation (til LP), tilskud fra Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (til LP og AD), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (til LP), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, til LP) og ITMO MIIC-tilskuddet (21CM044, til LP). Ud over finansiering fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram ERC StG 758170-Microbar (til LP) blev AD støttet af et stipendium fra Fondation de France.
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes | vWR | 87003-294 | |
15-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0451 | |
50-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0448 | |
96-well U-bottom culture plate | Falcon | 353077 | |
Anti-human Lin APC | Thermo Fisher | 22-7776-72 | Dilution 1/40 |
ARIA III | BD | Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate | |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Life Technologies | C34570 | |
Cell Trace Violet (CTV) | Life Technologies | C34571 | |
Compensation beads | BD | 552843 | |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies | 11320033 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Scientific | J62948-36 | Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water |
FC block Fc1.3216 | BD | 564220 | Dilution 1/50 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | S1900-500C | Batch S00CH |
FlowJo v10.8.1 | BD | ||
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a | Biolegend | 312216 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 | BD | 564195 | Dilution 1/15 |
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 | Biolegend | 343513 | Dilution 1/40 |
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 | Biolegend | 356620 | Dilution 1/40 |
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 | BD | 560673 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 | BD | 560675 | Dilution 1/20 |
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 | Biolegend | 328110 | Dilution 1/20 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Life Technologies | 10010001 | |
Python | |||
R | |||
Sterile 12×75 mm conical polypropylene tubes | Falcon | ||
ZE5 | Biorad | Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader | |
Laboratory prepared | |||
Cell culture media | Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use | ||
DMEM + 10% FBS | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM | ||
PBS 1X + EDTA 0.1% | Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X | ||
Staining buffer | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X |