Generazione e mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte da primati derivate dall'urina
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per isolare, espandere e riprogrammare cellule derivate dall’urina di primati umani e non umani in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), nonché istruzioni per il mantenimento senza alimentatore delle iPSC appena generate.
Abstract
Gli approcci interspecie che studiano le cellule staminali pluripotenti dei primati e i loro derivati sono cruciali per comprendere meglio i meccanismi molecolari e cellulari della malattia, dello sviluppo e dell’evoluzione. Per rendere le cellule staminali pluripotenti indotte dai primati (iPSC) più accessibili, questo articolo presenta un metodo non invasivo per generare iPSC di primati umani e non umani da cellule derivate dall’urina e il loro mantenimento utilizzando un metodo di coltura senza alimentatore.
L’urina può essere campionata da un ambiente non sterile (ad esempio, la gabbia dell’animale) e trattata con un cocktail antibiotico ad ampio spettro durante la coltura cellulare primaria per ridurre efficacemente la contaminazione. Dopo la propagazione delle cellule derivate dall’urina, le iPSC sono generate da un metodo di trasduzione modificato di un sistema vettoriale del virus Sendai disponibile in commercio. Le prime colonie di iPSC possono essere già visibili dopo 5 giorni e possono essere raccolte dopo 10 giorni al più presto. Il passaggio di routine del grumo con tampone di dissociazione privo di enzimi supporta la pluripotenza delle iPSC generate per più di 50 passaggi.
Introduction
I confronti genomici dei primati umani e non umani (NHP) sono cruciali per comprendere la nostra storia evolutiva e l’evoluzione dei tratti specifici dell’uomo1. Inoltre, questi confronti consentono l’inferenza della funzione identificando sequenze di DNA conservate2, ad esempio, per dare priorità alle varianti associate alla malattia3. I confronti di fenotipi molecolari come i livelli di espressione genica sono cruciali per interpretare meglio i confronti genomici e scoprire, ad esempio, le differenze fenotipiche cellulari. Inoltre, hanno – analogamente ai confronti a livello del DNA – il potenziale per dedurre la rilevanza funzionale, e quindi per interpretare meglio la variazione clinicamente rilevante all’interno degli esseri umani4. L’incorporazione di dati fenotipici molecolari completi in questi studi comparativi richiede risorse biologiche appropriate (cioè cellule ortologhe tra le specie). Tuttavia, ragioni etiche e pratiche rendono difficile o impossibile accedere a tali cellule comparabili, specialmente durante lo sviluppo. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) consentono la generazione di tali tipi di cellule inaccessibili in vitro5,6, sono sperimentalmente accessibili e sono state utilizzate per confronti di primati 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Per generare iPSC, è necessario acquisire le cellule primarie da riprogrammare. Le cellule isolate dalle urine hanno il vantaggio di poter essere campionate in modo non invasivo dai primati e di poter essere facilmente riprogrammate, probabilmente a causa dei loro profili molecolari simili alle cellule staminali15. Le condizioni colturali per mantenere le iPSC dei primati sono importanti quanto la riprogrammazione; Classicamente, la coltura di cellule staminali pluripotenti umane richiedeva un mezzo non definito, basato sul siero e una co-coltura di fibroblasti embrionali di topo – le cosiddette cellule feeder – che forniscono nutrienti essenziali e un’impalcatura per le cellule staminali embrionali (ESC)16. Dopo lo sviluppo di sistemi di coltura chimicamente definiti e privi di alimentazione17,18, ci sono ora varie opzioni di terreni di coltura e matrici iPSC disponibili in commercio. Tuttavia, la maggior parte di queste condizioni di coltura sono state ottimizzate per ESC e iPSC umane, e quindi potrebbero funzionare meno bene nella coltura NHP iPSC. In questo protocollo video, forniamo istruzioni per generare e mantenere iPSC umane e NHP derivate da colture cellulari urinarie.
Dal primo rapporto sulla generazione di iPSC mediante l’espressione forzata di fattori definiti nei fibroblasti nel 2006, questo metodo è stato applicato a molti diversi tipi cellulari di varia origine 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Tra questi, solo le cellule derivate dall’urina possono essere ottenute in modo completamente non invasivo. Sulla base del protocollo precedentemente descritto da Zhou et al.33, è possibile isolare ed espandere le cellule dall’urina dei primati anche da campioni non sterili, integrando antibiotici ad ampio spettro15. In particolare, le cellule derivate dall’urina campionate da questo protocollo mostrano un alto potenziale di produrre iPSC, in un periodo di tempo più breve (le colonie diventano visibili in 5-15 giorni) rispetto alla riprogrammazione convenzionale dei fibroblasti (20-30 giorni, nella nostra esperienza) e con un tasso di successo sufficientemente elevato. Queste cellule derivate dall’urina sono state classificate come popolazione mista di cellule staminali mesenchimali simili e cellule epiteliali della vescica, causando l’elevata efficienza di riprogrammazione15.
Oltre alla variazione nelle celle primarie, anche i metodi di riprogrammazione per generare iPSC variano a seconda dello scopo di utilizzo. Le procedure convenzionali di riprogrammazione per le cellule somatiche umane sono state effettuate mediante la sovraespressione di fattori di riprogrammazione con vettori di retrovirus o lentivirus, che hanno permesso l’integrazione del DNA esogeno nel genoma 5,34,35. Per mantenere intatte le iPSC generate, i ricercatori hanno sviluppato un’ampia varietà di sistemi non di integrazione – vettore PiggyBac asportabile36,37, vettore episomiale38,39, vettori virali non integranti come il virus Sendai 40 e adenovirus 41, trasfezione mRNA42, trasfezione proteica 43,44 e trattamento con composti chimici 45. A causa dell’efficienza e della facilità di gestione, i vettori di riprogrammazione basati su virus Sendai vengono utilizzati in questo protocollo. L’infezione delle cellule primarie viene eseguita in una coltura in sospensione di 1 ora di cellule e virus a una molteplicità di infezione (MOI) di 5 prima della placcatura. Questo passaggio modificato potrebbe aumentare la probabilità di contatto tra superfici cellulari e virus, rispetto al metodo convenzionale in cui i virus vengono aggiunti direttamente alla coltura cellulare aderente, e quindi produrre più colonie iPSC15.
Il passaggio delle cellule staminali pluripotenti umane e NHP può essere effettuato mediante passaggio di grumi e passaggio di singole cellule. L’acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) è un agente chelante economico che lega gli ioni di calcio e magnesio e quindi impedisce l’attività aderente della caderina e dell’integrina. L’EDTA è anche usato come reagente di dissociazione lieve e selettiva, poiché le cellule indifferenziate si staccano prima delle cellule differenziate a causa delle loro diverse molecole di adesione. La dissociazione completa induce la morte cellulare massiccia delle iPSC dei primati attraverso l’iperattivazione della miosina mediata dalla bobina a spirale associata a Rho/Rho contenente la proteina chinasi (Rho/Rock). Pertanto, l’integrazione del terreno di coltura con un inibitore Rho/Rock è essenziale per esperimenti che richiedono singole cellule in sospensione46,47. In questo protocollo, raccomandiamo il clump passaging come metodo di passaggio di routine e raccomandiamo il passaging a singola cella solo quando è necessario, ad esempio, quando è richiesta la semina di numeri di celle definiti o durante la sub-clonazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le iPSC sono tipi di cellule preziose in quanto consentono la generazione di tipi cellulari altrimenti inaccessibili in vitro. Poiché i materiali di partenza per la riprogrammazione, ad esempio, i fibroblasti non sono facilmente disponibili da tutte le specie di primati, questo documento presenta un protocollo per la generazione di iPSC da cellule derivate dall’urina. Queste cellule possono essere ottenute in modo non invasivo, anche da campioni di urina di primati non sterili, integrando il terreno di coltura …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da DFG EN 1093/5-1 (numero di progetto 458247426). M.O. è stato supportato da JSPS Overseas Research Fellowship. Tutte le figure sono state create con BioRender.com. La citometria a flusso è stata eseguita con l’aiuto del Core Facility Flow Cytometry presso il Biomedical Center di Monaco. Vorremmo ringraziare Makoto Shida e Tomoyo Muto di ASHBi, Università di Kyoto, per il supporto della videografia.
Materials
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
Riferimenti
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