בידוד וטיהור של β-גלוקן פטרייתי כאסטרטגיה אימונותרפית לגליובלסטומה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שלבי הטיהור ואת המחקרים הבאים של ארבעה β-גלוקנים פטרייתיים שונים כמולקולות אימונומודולטוריות פוטנציאליות המשפרות את התכונות האנטי-גידוליות של תאי מיקרוגליה כנגד תאי גליובלסטומה.
Abstract
אחד האתגרים הגדולים ביותר בפיתוח טיפולים יעילים נגד גליובלסטומה הוא התגברות על הדיכוי החיסוני החזק בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. אימונותרפיה התפתחה כאסטרטגיה יעילה להפוך את תגובת מערכת החיסון נגד תאים סרטניים. מקרופאגים ותאי מיקרוגליה הקשורים לגליומה (GAMs) הם הגורמים העיקריים לתרחישים אנטי-דלקתיים כאלה. לכן, שיפור התגובה האנטי-סרטנית ב-GAMs עשוי להוות טיפול קו-אדג’ובנטי פוטנציאלי לטיפול בחולי גליובלסטומה. ברוח זו, מולקולות β-גלוקן פטרייתיות ידועות מזה זמן רב כאפנון חיסוני רב עוצמה. תוארה יכולתם לעורר את הפעילות החיסונית המולדת ולשפר את התגובה הטיפולית. תכונות אפנון אלה מיוחסות בחלקן ליכולתן להיקשר לקולטני זיהוי דפוסים, אשר, באופן מעניין, באים לידי ביטוי רב ב- GAMs. לפיכך, עבודה זו מתמקדת בבידוד, טיהור ושימוש עוקב של β-גלוקנים פטרייתיים כדי לשפר את התגובה הגידולית של מיקרוגליה נגד תאי גליובלסטומה. קווי התאים גליובלסטומה של עכבר (GL261) ומיקרוגליה (BV-2) משמשים לבדיקת התכונות האימונומודולטוריות של ארבעה β-גלוקנים פטרייתיים שונים המופקים מפטריות שנמצאות בשימוש נרחב בתעשיית הביו-פרמצבטיקה הנוכחית: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ו-Ganoderma lucidum. כדי לבדוק תרכובות אלה, בוצעו בדיקות גירוי משותף כדי למדוד את ההשפעה של תווך מותנה מיקרוגליה מופעל מראש על התפשטות והפעלת אפופטוזיס בתאי גליובלסטומה.
Introduction
למרות כניסתם של הישגים חדשים בתחום הנוירו-אונקולוגיה, תוחלת החיים של חולי גליובלסטומה נותרה דלה. טיפולים סטנדרטיים נגד גידולי מוח מבוססים על מיזוג של ניתוחים, הקרנות וכימותרפיה. עם זאת, בעשור האחרון, אימונותרפיה התפתחה כאסטרטגיה רבת עוצמה לטיפול בסוגים שונים של סרטן1. כך, האפשרות לרתום את התגובה החיסונית של הגוף נגד תאים סרטניים הפכה לאחרונה לעמוד התווך הרביעי של האונקולוגיה.
זה זמן רב ידוע כי אחד האתגרים הגדולים בתחום הוא להתגבר על הדיכוי החיסוני החזק שנמצא בתוך מיקרו-סביבה של הגידול2. בפרט, במקרה של גליובלסטומה, אחת הצורות הנפוצות והאגרסיביות ביותר של סרטן המוח, חשיפת מסלולים מרכזיים המתזמרים תרחישים פרו-גידוליים כאלה ומציאת תרכובות חדשות שיכולות לנטרל את התגובה המדכאת של מערכת החיסון עשויה לסלול את הדרך לטיפולים עתידיים נגד מחלה חשוכת מרפא זו.
למוח יש תאי מערכת חיסון משלו, וסוג התא הרלוונטי ביותר הוא מיקרוגליה. תאים אלה הוכחו כבעלי התנהגות מורכבת למדי על פני מחלות מרכזיות שונות3. במקרה של גידולי מוח ראשוניים (למשל, גליובלסטומה), תאים אלה מוסטים לכיוון פנוטיפ אנטי דלקתי התומך בתאי הגידול כדי ליישב אתפרנכימה 3 במוח. פרסומים רבים שיפרו את התפקיד העיקרי של תאים אלה במהלך התקדמות הגידול. אחת הסיבות העיקריות לכך היא שתאי מיקרוגליה הקשורים לגליומה ומקרופאגים מסתננים (GAMs) מהווים שליש ממסת הגידול הכוללת, מה שמרמז על ההשפעה החד משמעית של מצבי ההפעלה שלהם במהלך התקדמות הגידול במוח 4,5.
ברוח זו, β-גלוקנים פטרייתיים תוארו כמולקולות חזקות המפעילות תגובות חיסוניות יעילות, כולל פגוציטוזה וייצור גורמים מעודדי דלקת, המובילים לסילוק חומרים מזיקים 6,7,8,9,10. β-גלוקנים פטרייתיים נחקרו בדרך כלל באמצעות תמציות מחלקי פטריות שונים. עם זאת, ייחוס של השפעות ספציפיות דורש טיהור שלה כדי למנוע עמימות כדי להיות מסוגל להבין את מנגנון הפעולה של מולקולות כגון סוכני immunomodulatory8.
בעבודה זו, β-גלוקנים מסיסים מטוהרים מגוף הפרי של ארבע פטריות שונות, בשימוש קבוע כאכילים (Pleurotus ostreatus ו- Pleurotus djamor) וכפטריות מרפא (Ganoderma lucidum ו – Hericium erinaceus). בפרט, לארבע פטריות אלה יש שימוש רב בתעשיית המזון והתרופות והן יוצרו במסגרת כלכלה מעגלית ידידותית לסביבה במפעל מסחרי (ראו טבלת חומרים).
על מנת להניח את היסודות לשימוש עתידי של β-גלוקנים פטרייתיים בטיפולים בסרטן המוח, אסטרטגיות טיהור מוגדרות היטב ומחקרים פרה-קליניים המתעמקים באינטראקציה המשוערת שלהם עם תאי מערכת החיסון חיוניים להערכת תפקידם הפוטנציאלי כמתווכים נגד גידולים. עבודה זו מתארת את השלבים הרבים של בידוד וטיהור הדרושים כדי להחזיר את β-גלוקנים מסיסים הכלולים בגופי הפרי של הפטרייה שנבחרה. לאחר טיהור מוצלח, תאי מיקרוגליה מופעלים כדי לשפר את הפנוטיפ הדלקתי שלהם. תאי גליובלסטומה של עכבר (GL261) מצופים בתווך מותנה אחר המותנה במיקרוגליה, שטופל בעבר בתמציות אלה, ולאחר מכן מוערכת השפעתו על התנהגות תאי הגידול. באופן מעניין, מחקרי פיילוט מהמעבדה שלנו (נתונים לא מוצגים) חשפו כיצד תאי מיקרוגליה פרו-דלקתיים עשויים להאט את נדידת תאי הגידול ואת תכונות הפלישה לא רק בתאי גליובלסטומה אלא גם בשורות תאים סרטניים אחרים. עבודה רב-תחומית זו עשויה לספק כלי שימושי לחוקרי אונקולוגיה לבחון תרכובות מבטיחות המסוגלות להגביר את התגובה החיסונית בסוגים רבים ושונים של גידולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת את השימוש בטכניקות מבוססות היטב כדי לבודד, לטהר ולאפיין בהצלחה את התוכן של SβGs מארבע פטריות שונות. התוצאות הראו כיצד לאחר מיצוי מים חמים של SMPs, שהתקבלו מ- P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו- H. erinaceus, ולאחר מכן טיפול הידרוליטי עם α-עמילאז, גלוקוזידאז ופרוטאז, התוכן של α-גלו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר ואסיליקי אקונומופולוס על התסריט הפנימי שלה למדידת אות המילוי ב-ImageJ. ברצוננו גם להודות ל-CITIUS (אוניברסיטת סביליה) ולכל אנשיהם על תמיכתם במהלך ההפגנה. עבודה זו נתמכה על ידי הפדרציה הספרדית I + D + i-USE, US-1264152 מאוניברסיטת סביליה, ואת Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
Riferimenti
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M. Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Ricerca sul cancro. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
