De nuværende metoder beskriver en ikke-ratiometrisk tilgang til calciumbilleddannelse i høj opløsning i subcompartment in vivo i Caenorhabditis elegans ved hjælp af let tilgængelige genetisk kodede calciumindikatorer.
Calcium (Ca 2+) billeddannelse er i vid udstrækning blevet brugt til at undersøge neuronal aktivitet, men det bliver stadig mere klart, at subcellulær Ca2+ håndtering er en afgørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen af subcellulær Ca2+ dynamik in vivo, hvor neuroner kan studeres i deres oprindelige, intakte kredsløb, har vist sig teknisk udfordrende i komplekse nervesystemer. Gennemsigtigheden og det relativt enkle nervesystem hos nematoden Caenorhabditis elegans muliggør cellespecifik ekspression og in vivo-visualisering af fluorescerende tags og indikatorer. Blandt disse er fluorescerende indikatorer, der er blevet modificeret til brug i cytoplasmaet, såvel som forskellige subcellulære rum, såsom mitokondrier. Denne protokol muliggør ikke-ratiometrisk Ca 2+ billeddannelse in vivo med en subcellulær opløsning, der tillader analyse af Ca2+ dynamik ned til niveauet for individuelle dendritiske rygsøjler og mitokondrier. Her bruges to tilgængelige genetisk kodede indikatorer med forskellige Ca 2+ affiniteter til at demonstrere brugen af denne protokol til måling af relative Ca2+ niveauer inden for cytoplasma eller mitokondriematrix i et enkelt par excitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulationer og langsgående observationer, der er mulige i C. elegans, kan denne billeddannelsesprotokol være nyttig til at besvare spørgsmål om, hvordan Ca2+ håndtering regulerer neuronal funktion og plasticitet.
Calciumioner (Ca2+) er meget alsidige bærere af information i mange celletyper. I neuroner er Ca2+ ansvarlig for den aktivitetsafhængige frigivelse af neurotransmittere, reguleringen af cytoskeletal motilitet, finjustering af metaboliske processer samt mange andre mekanismer, der kræves for korrekt neuronal vedligeholdelse og funktion 1,2. For at sikre effektiv intracellulær signalering skal neuroner opretholde lave basale Ca2+ niveauer i deres cytoplasma3. Dette opnås ved hjælp af kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, herunder optagelse af Ca2+ i organeller såsom endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse processer, ud over arrangementet af Ca 2+-permeable ionkanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene niveauer af cytoplasmatisk Ca2+ i hele neuronen.
Ca 2+ heterogenitet under hvile og neuronal aktivering giver mulighed for forskelligartet, placeringsspecifik regulering af Ca 2+-afhængige mekanismer 1. Et eksempel på de koncentrationsspecifikke virkninger af Ca 2+ er frigivelsen af Ca 2+ fra ER gennem inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP 3) receptorer. Lave Ca2+ niveauer i kombination med InsP3 er nødvendige for åbningen af receptorens calciumgennemtrængelige pore. Alternativt hæmmer høje Ca2+ niveauer både direkte og indirekte receptoren4. Betydningen af Ca 2+ homeostase for korrekt neuronal funktion understøttes af beviser, der tyder på, at forstyrret intracellulær Ca2+ håndtering og signalering er et tidligt skridt i patogenesen af neurodegenerative lidelser og naturlig aldring 5,6. Specifikt er unormal Ca2+ optagelse og frigivelse af ER og mitokondrier forbundet med begyndelsen af neuronal dysfunktion ved Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom 6,7.
Undersøgelsen af Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller neurodegeneration kræver langsgående observation af Ca2+ niveauer med subcellulær opløsning i en levende, intakt organisme, hvor den oprindelige cellulære arkitektur (dvs. arrangementet af synapser og fordeling af ionkanaler) opretholdes. Til dette formål giver denne protokol vejledning om brugen af to let tilgængelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer til registrering af Ca2+ dynamik in vivo med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. De repræsentative resultater opnået ved hjælp af den beskrevne metode i C. elegans demonstrerer, hvordan ekspressionen af Ca 2+ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriematrix af enkelte neuroner kan muliggøre hurtig erhvervelse af fluorescerende billeder (op til 50 Hz), der illustrerer Ca 2+ dynamikken med den ekstra evne til at skelne Ca 2+ niveauerne inden for enkelt rygsøjlelignende strukturer og individuelle mitokondrier.
Den første overvejelse ved implementering af den beskrevne metode indebærer valg af en Ca2+ indikator med ideelle egenskaber for det givne forskningsspørgsmål. Cytoplasmatiske Ca 2+ indikatorer har typisk en høj affinitet for Ca 2+, og følsomheden af disse indikatorer over for Ca2+ er omvendt relateret til kinetikken (on/off rate)16,17. Det betyder, at enten Ca2+ følsomhed eller kinetik skal prioritere…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tildelt F. Hoerndli). Vi vil også gerne takke Dr. Attila Stetak for pAS1-plasmidet.
100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
pBSKS | Stratagene | ||
pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |