Subcellulär avbildning av neuronal kalciumhantering in vivo

Summary

De nuvarande metoderna beskriver en icke-ratiometrisk metod för högupplöst, subkompartmentell kalciumavbildning in vivo i Caenorhabditis elegans med hjälp av lättillgängliga genetiskt kodade kalciumindikatorer.

Abstract

Kalcium (Ca²⁺) avbildning har till stor del använts för att undersöka neuronal aktivitet, men det blir allt tydligare att subcellulär Ca^{2 +} hantering är en avgörande komponent i intracellulär signalering. Visualiseringen av subcellulär Ca²⁺ dynamik in vivo, där neuroner kan studeras i sina infödda, intakta kretsar, har visat sig vara tekniskt utmanande i komplexa nervsystem. Transparensen och det relativt enkla nervsystemet hos nematoden Caenorhabditis elegans möjliggör cellspecifikt uttryck och in vivo-visualisering av fluorescerande taggar och indikatorer. Bland dessa är fluorescerande indikatorer som har modifierats för användning i cytoplasman såväl som olika subcellulära fack, såsom mitokondrier. Detta protokoll möjliggör icke-ratiometrisk Ca 2+ avbildning in vivo med en subcellulär upplösning som möjliggör analys av Ca²⁺ dynamik ner till nivån för enskilda dendritiska ryggar och mitokondrier. Här används två tillgängliga genetiskt kodade indikatorer med olika Ca 2+ affiniteter för att demonstrera användningen av detta protokoll för att mäta relativa Ca²⁺ nivåer inom cytoplasman eller mitokondriell matris i ett enda par excitatoriska interneuroner (AVA). Tillsammans med de genetiska manipulationer och longitudinella observationer som är möjliga i C. elegans kan detta avbildningsprotokoll vara användbart för att svara på frågor om hur Ca²⁺ hantering reglerar neuronal funktion och plasticitet.

Introduction

Kalciumjoner (Ca²⁺) är mycket mångsidiga bärare av information i många celltyper. I neuroner är Ca²⁺ ansvarig för den aktivitetsberoende frisättningen av neurotransmittorer, regleringen av cytoskeletal motilitet, finjustering av metaboliska processer, liksom många andra mekanismer som krävs för korrekt neuronalt underhåll och funktion ^1,2. För att säkerställa effektiv intracellulär signalering måste neuroner upprätthålla låga basala Ca²⁺ nivåer i sin cytoplasma³. Detta uppnås genom kooperativa Ca 2+ hanteringsmekanismer, inklusive upptag av Ca²⁺ i organeller såsom endoplasmatisk retikulum (ER) och mitokondrier. Dessa processer, förutom arrangemanget av Ca2+-permeabla jonkanaler i plasmamembranet, resulterar i heterogena nivåer av cytoplasmatisk^Ca2+ i hela neuronen.

Ca 2+ heterogenitet under vila och neuronal aktivering möjliggör mångfaldig, platsspecifik reglering av Ca²⁺-beroende mekanismer ¹. Ett exempel på de koncentrationsspecifika effekterna av Ca 2+ är frisättningen av Ca²⁺ från ER genom inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP₃) receptorer. Låga Ca2⁺ nivåer i kombination med InsP₃ krävs för öppning av receptorns kalciumpermeabla porer. Alternativt hämmar höga Ca²⁺ nivåer både direkt och indirekt receptorn⁴. Betydelsen av Ca 2+ homeostas för korrekt neuronal funktion stöds av bevis som tyder på att störd intracellulär Ca²⁺ hantering och signalering är ett tidigt steg i patogenesen av neurodegenerativa störningar och naturligt åldrande ^5,6. Specifikt är onormalt upptag och frisättning av Ca²⁺ av ER och mitokondrier kopplade till uppkomsten av neuronal dysfunktion vid Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom ^6,7.

Studien av Ca 2+ dyshomeostas under naturligt åldrande eller neurodegeneration kräver longitudinell observation av Ca²⁺ nivåer med subcellulär upplösning i en levande, intakt organism där den ursprungliga cellulära arkitekturen (dvs arrangemanget av synapser och distribution av jonkanaler) upprätthålls. För detta ändamål ger detta protokoll vägledning om användningen av två lättillgängliga, genetiskt kodade Ca 2+ sensorer för inspelning av Ca²⁺ dynamik in vivo med hög rumslig och tidsmässig upplösning. De representativa resultaten som förvärvats med den beskrivna metoden i C. elegans visar hur uttrycket av Ca 2+ indikatorer i cytoplasman eller mitokondriell matris av enskilda neuroner kan möjliggöra snabb förvärv av fluorescerande bilder (upp till 50 Hz) som illustrerar Ca 2+ dynamiken med den ytterligare förmågan att urskilja Ca ²⁺ nivåer inom enskilda ryggradsliknande strukturer och individuella mitokondrier.

Protocol

1. Skapa transgena stammar Med hjälp av valfri kloningsmetod8,9 ska klonuttrycksvektorer innehålla promotorn Pflp-18 eller Prig-3 (för AVA-specifik signal i den ventrala nervkabeln), följt av valfri Ca2+-indikator, och sedan en 3′ UTR (se diskussionen för mer information)10. En förteckning över plasmider och deras källor finns i kompletterande tabell 1. …

Representative Results

Dessa två protokoll möjliggör snabb förvärv av differentiella Ca2+ nivåer inom de subcellulära regionerna och organellerna hos enskilda neuriter in vivo med hög rumslig upplösning. Det första protokollet möjliggör mätning av cytoplasmatisk Ca2+ med hög tidsmässig och rumslig upplösning. Detta demonstreras här med hjälp av det cellspecifika uttrycket av GCaMP6f i glutamaterga AVA-kommandointerneuroner15, vars neuriter löper hela längden av den vent…

Discussion

Det första övervägandet vid implementering av den beskrivna metoden innefattar val av en Ca²⁺ indikator med ideala egenskaper för den givna forskningsfrågan. Cytoplasmatiska Ca 2+ indikatorer har vanligtvis en hög affinitet för Ca 2+, och känsligheten hos dessa indikatorer för Ca ²⁺ är omvänt relaterad till kinetiken (på / av-hastighet) ^16,17. Detta innebär att antingen Ca²⁺ känslighet eller kin…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2