Udvikling af Leishmania-artsstammer med konstitutiv ekspression af eGFP

Summary

Her beskriver vi den metode, der anvendes til at generere L. panamensis – og L. donovani-stammer , der udtrykker genet for eGFP som et stabilt integreret transgen ved hjælp af pLEXSY-systemet. Transfekterede parasitter blev klonet ved at begrænse fortynding, og kloner med den højeste fluorescensintensitet i begge arter blev udvalgt til videre brug i lægemiddelscreeningsanalyser.

Abstract

Protozoiske parasitter af slægten Leishmania forårsager leishmaniasis , en sygdom med variable kliniske manifestationer, der rammer millioner af mennesker over hele verden. Infektion med L. donovani kan resultere i dødelig visceral sygdom. I Panama, Colombia og Costa Rica er L. panamensis ansvarlig for de fleste af de rapporterede tilfælde af kutan og mucokutan leishmaniasis. At studere et stort antal lægemiddelkandidater med de metoder, der er tilgængelige til dato, er ret vanskeligt, da de er meget besværlige til evaluering af forbindelsernes aktivitet mod intracellulære former af parasitten eller til udførelse af in vivo-assays . I dette arbejde beskriver vi dannelsen af L. panamensis – og L. donovani-stammer med konstitutiv ekspression af genet, der koder for et forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) integreret i locus, der koder for 18S rRNA (ssu). Genet, der koder for eGFP, blev opnået fra en kommerciel vektor og amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) for at berige det og tilføje restriktionssteder for BglII- og KpnI-enzymerne. eGFP-amplikonen blev isoleret ved agarosegelrensning, fordøjet med enzymerne BglII og KpnI og ligeret i Leishmania-ekspressionsvektoren pLEXSY-sat2.1, der tidligere var fordøjet med det samme sæt enzymer. Ekspressionsvektoren med det klonede gen blev formeret i E. coli, renset, og tilstedeværelsen af indsatsen blev verificeret ved koloni PCR. Det rensede plasmid blev lineæriseret og brugt til at transfektere L. donovani og L . panamensis parasitter. Integrationen af genet blev verificeret ved PCR. Ekspressionen af eGFP-genet blev evalueret ved flowcytometri. Fluorescerende parasitter blev klonet ved at begrænse fortynding, og kloner med den højeste fluorescensintensitet blev valgt ved anvendelse af flowcytometri.

Introduction

Protozoiske parasitter af slægten Leishmania forårsager leishmaniasis, en sygdom med en bred vifte af kliniske manifestationer. Denne sygdom er udbredt i 98 lande, og dens årlige forekomst anslås til 0,9 til 1,6 millioner tilfælde¹. Leishmania-arter, der er patogene for mennesker, er opdelt i to underslægter, nemlig L. (Leishmania) og L. (Viannia). Infektion med nogle arter, der tilhører L. (Leishmania) underslægt, såsom L. donovani og L. infantum, kan resultere i visceral leishmaniasis (VL), som er dødelig, hvis den ikke behandles². Arter tilhørende L. (Viannia) subgenus er forbundet med de fleste tilfælde af kutan leishmaniasis (CL) og mucokutan leishmaniasis (MCL) i Central- og Sydamerika, især i Panama, Colombia og Costa Rica, hvor L. panamensis er det vigtigste ætiologiske middel til disse kliniske præsentationer ^3,4.

Eksisterende anti-leishmania kemoterapi, der omfatter lægemidler som pentavalente antimonials, miltefosin og amphotericin B er meget giftig og dyr. Desuden er øget lægemiddelresistens i de seneste årtier blevet føjet til de faktorer, der forstyrrer effektiv behandling af patienter over hele verden⁵. Der er påvist betydelige forskelle på tværs af arter af slægten Leishmania i forhold til lægemiddelfølsomhed, især mellem New og Old World arter ^6,7. Af disse grunde er det nødvendigt at rette indsatsen mod identifikation og udvikling af nye lægemidler mod leishmani, idet der lægges særlig vægt på artsspecifikke tilgange. Det er ret vanskeligt at studere store biblioteker af lægemiddelkandidater med traditionelle metoder, da disse metoder er meget besværlige til evaluering af forbindelsernes aktivitet mod intracellulære amastigoter eller til udførelse af in vivo-eksperimenter ⁸; Derfor har det været nødvendigt at udvikle nye teknikker, der reducerer disse ulemper, herunder implementering af reportergener og udvikling af fænotypiske screeningsassays med højt indhold⁹.

Brugen af reportergener har vist potentialet til at øge effektiviteten af lægemiddelscreeningsprocessen, da det letter udviklingen af high-throughput og in vivo-assays. Rekombinante Leishmania-parasitter, der udtrykker flere reportergener, er blevet genereret af forskellige forskergrupper. Reportergener, såsom β-galactosidase, β-lactamase og luciferase, er blevet introduceret i flere Leishmania-arter ved hjælp af episomale vektorer, hvilket viser begrænset anvendelighed til lægemiddelscreening i ekstra- og intracellulære former af parasitten 10,11,12,13,14,15. Disse tilgange har begrænsningen ved at kræve et stærkt selektivt tryk i kultur for at undgå eliminering af den episomale konstruktion samt brugen af yderligere reagenser til at afsløre aktiviteten af reportergenet. Omvendt er det grønne fluorescerende protein (GFP) og dets variant, det forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP), blevet anvendt til generering af et stort antal transgene Leishmania-stammer til di vitro-lægemiddelscreeningsassays på grund af deres fleksibilitet og følsomhed samt muligheden for at automatisere screeningsprocessen ved hjælp af flowcytometri eller fluorometri^{15, 16,17,18,19}. På trods af lovende resultater var kulturer af disse transgene stammer meget heterogene i deres fluorescensniveauer, da antallet af kopier af GFP-genet ikke var det samme i alle parasitterne. Desuden krævede opretholdelse af fluorescens konstant selektivt tryk på parasitterne i kultur, da GFP-genet blev introduceret i en episomal konstruktion.

Af de grunde, der er nævnt ovenfor, har mange bestræbelser fokuseret på at udvikle nye metoder til fremstilling af stabile rekombinante stammer. Disse bestræbelser har for det meste været afhængige af integrationen af reportergener i ribosomale loci og udnyttet de højere transkriptionshastigheder for ribosomale gener²⁰. Stammer af L. infantum og L. amazonensis er blevet genereret efter at have integreret generne, der koder for β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP²² og tdTomato²³, og de er blevet evalueret for deres anvendelighed i lægemiddelscreeningsassays. Forskellige grupper har udviklet L. donovani-stammer, der udtrykker GFP konstitutivt ved at integrere dets kodende gen i 18S ribosomalt RNA-locus (ssu locus) gennem homolog rekombination^24,25; de viste stabil og homogen GFP-ekspression i den transfekterede population, herunder intracellulære amastigoter 24,25, og de blev med succes implementeret i lægemiddelscreeningsassays^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 udviklede stammer af L. major og L. infantum, der udtrykker GFP som et integreret transgen. De brugte integrationsvektoren pLEXSY, oprindeligt designet til transgen ekspression af proteiner i et system med L. tarentolae som vært²⁸. pLEXSY-GFP-vektoren har vist sig at være meget effektiv til generering af forskellige Leishmania-stammer, der konstitutivt udtrykker GFP 24,25,27,29,30. I disse parasitter er fluorescens homogen og opretholdes i de intracellulære former, idet den kan påvises i fodpudelæsioner af inficerede mus²⁷.

I dette arbejde beskriver vi den metode, der anvendes til generering af L. panamensis – og L. donovani-stammer , der udtrykker genet, der koder for eGFP, som et integreret transgen ved hjælp af pLEXSY-systemet. De stammer, der genereres gennem denne proces, bruges i vores laboratorium til at udføre lægemiddelscreeningsassays, der evaluerer den potentielle anti-leishmania-aktivitet af molekyler af naturlig og syntetisk oprindelse.

Protocol

For at holde prøverne sterile skal alle trin, der involverer parasitkultur, udføres inde i en hætte til biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) eller i henhold til lokale sundheds- og sikkerhedsbestemmelser. Et grafisk resumé af denne protokol findes i figur 1. Figur 1: Resumé af protokollen til generering af eGFP-ekspressive L. pa…

Representative Results

Efter opbygning af pLEXSY-eGFP-konstruktionen og transformering af kompetente E. coli-celler vil kolonier, der indeholder konstruktionen med eGFP-indsatsen, generere et produkt på ca. 859 bp efter kørsel af koloni-PCR beskrevet i afsnit 1.2 (figur 3A). Total fordøjelse af det rensede plasmid fra positive kolonier ved anvendelse af SwaI bør give to karakteristiske fragmenter i gelelektroforese, et 2,9 kbp fragment, der er den del af PLEXSY-vektoren, der indeholder alle d…

Discussion

Fordele og ulemper ved forskellige reportergener er blevet undersøgt i flere protozoiske parasitter. Blandt dem er GFP og eGFP iboende fluorescerende og muliggør let kvantificering og billeddannelse. Den fluorescerende aktivitet af disse proteiner kan detekteres med minimal manipulation ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, fluorimetri eller flowcytometri. Der er kun udført få undersøgelser for at generere GFP-ekspressiv L. (Viannia) stammer, på trods af den påviste robusthed af GFP og deres d…

Materials

96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.