ईजीएफपी की संवैधानिक अभिव्यक्ति के साथ लीशमैनिया प्रजाति उपभेदों का विकास
Summary
यहां, हम पीएलईएक्सएसवाई प्रणाली का उपयोग करके एक स्थिर एकीकृत ट्रांसजीन के रूप में ईजीएफपी के लिए जीन को व्यक्त करने वाले एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का वर्णन करते हैं। ट्रांसक्रिप्टेड परजीवियों को कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोन किया गया था, और दोनों प्रजातियों में उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता वाले क्लोन को ड्रग स्क्रीनिंग परख में आगे उपयोग के लिए चुना गया था।
Abstract
लीशमैनिया जीनस के प्रोटोजोआ परजीवी लीशमैनियासिस का कारण बनते हैं, परिवर्तनीय नैदानिक अभिव्यक्तियों के साथ एक बीमारी जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करती है। डोनोवानी के संक्रमण के परिणामस्वरूप घातक आंत की बीमारी हो सकती है। पनामा, कोलंबिया और कोस्टा रिका में, एल पैनामेंसिस त्वचीय और म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस के अधिकांश रिपोर्ट किए गए मामलों के लिए जिम्मेदार है। आज तक उपलब्ध पद्धतियों के साथ बड़ी संख्या में दवा उम्मीदवारों का अध्ययन करना काफी मुश्किल है, यह देखते हुए कि वे परजीवी के इंट्रासेल्युलर रूपों के खिलाफ यौगिकों की गतिविधि का मूल्यांकन करने या विवो परख में प्रदर्शन करने के लिए बहुत श्रमसाध्य हैं। इस काम में, हम जीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति के साथ एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी उपभेदों की पीढ़ी का वर्णन करते हैं जो 18 एस आरआरएनए (एसएसयू) के लिए एन्कोड करने वाले लोकस में एकीकृत एक उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के लिए एन्कोड करता है। जीन एन्कोडिंग ईजीएफपी को एक वाणिज्यिक वेक्टर से प्राप्त किया गया था और इसे समृद्ध करने और बीजीएलII और केपीएनआई एंजाइमों के लिए प्रतिबंध साइटों को जोड़ने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा प्रवर्धित किया गया था। ईजीएफपी एम्प्लिकॉन को एगारोस जेल शुद्धिकरण द्वारा अलग किया गया था, एंजाइम बीजीएलII और केपीएनI के साथ पचाया गया था, और लीशमैनिया अभिव्यक्ति वेक्टर pLEXSY-sat2.1 में मिलाया गया था जो पहले एंजाइमों के एक ही सेट के साथ पच गया था। क्लोन जीन के साथ अभिव्यक्ति वेक्टर को ई कोलाई में प्रचारित किया गया था, शुद्ध किया गया था, और डालने की उपस्थिति को कॉलोनी पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था। शुद्ध प्लास्मिड को रैखिक बनाया गया था और इसका उपयोग एल डोनोवानी और एल पैनामेंसिस परजीवी को स्थानांतरित करने के लिए किया गया था। जीन के एकीकरण को पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था। ईजीएफपी जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। फ्लोरोसेंट परजीवी को कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोन किया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता वाले क्लोन का चयन किया गया था।
Introduction
लीशमैनिया जीनस के प्रोटोजोआ परजीवी लीशमैनियासिस का कारण बनते हैं, जो नैदानिक अभिव्यक्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक बीमारी है। यह बीमारी 98 देशों में प्रचलित है, और इसकी वार्षिक घटना 0.9 से 1.6मिलियन मामलों का अनुमान है। लीशमैनिया प्रजातियां जो मनुष्यों के लिए रोगजनक हैं, उन्हें दो उप-वंशों में विभाजित किया गया है, अर्थात् एल। (लीशमैनिया) और एल। (वियानिया)। एल से संबंधित कुछ प्रजातियों के साथ संक्रमण। (लीशमैनिया) उपजीनस, जैसे कि एल डोनोवानी और एल इन्फेंटम, के परिणामस्वरूप आंत का लीशमैनियासिस (वीएल) हो सकता है, जोअनुपचारित छोड़ दिए जाने पर घातक है। एल से संबंधित प्रजातियां। (वियानिया) उप-जीनस मध्य और दक्षिण अमेरिका में त्वचीय लीशमैनियासिस (सीएल) और म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस (एमसीएल) के अधिकांश मामलों से जुड़े हैं, विशेष रूप से पनामा, कोलंबिया और कोस्टा रिका में, एल पैनामेंसिस इन नैदानिक प्रस्तुतियों का मुख्य एटियलॉजिकल एजेंट है।
मौजूदा एंटी-लीशमैनिया कीमोथेरेपी जिसमें पेंटावेलेंट एंटीमोनियल, मिल्टेफॉसिन और एम्फोटेरिसिन बी जैसी दवाएं शामिल हैं, अत्यधिक विषाक्त और महंगी हैं। इसके अलावा, हाल के दशकों के दौरान दवा प्रतिरोध में वृद्धि को उन कारकों में जोड़ा गया हैजो दुनिया भर में रोगियों के प्रभावी उपचार में हस्तक्षेप करते हैं। दवा संवेदनशीलता के संबंध में जीनस लीशमैनिया की प्रजातियों में पर्याप्त अंतर प्रदर्शित किए गए हैं, खासकर नई और पुरानी दुनिया की प्रजातियों 6,7 के बीच। इन कारणों से, प्रजाति-विशिष्ट दृष्टिकोणों पर विशेष ध्यान देते हुए, नई एंटी-लीशमैनिया दवाओं की पहचान और विकास के प्रयासों को निर्देशित करना आवश्यक है। पारंपरिक पद्धतियों के साथ दवा उम्मीदवारों के बड़े पुस्तकालयों का अध्ययन करना काफी मुश्किल है, यह देखते हुए कि ये पद्धतियां इंट्रासेल्युलर एमेस्टिगोट्स के खिलाफ यौगिकों की गतिविधि का मूल्यांकन करने या विवो प्रयोगों में प्रदर्शन करने के लिए बहुत श्रमसाध्य हैं। इसलिए, नई तकनीकों को विकसित करना आवश्यक हो गया है जो इन नुकसानों को कम करते हैं, जिसमें रिपोर्टर जीन का कार्यान्वयन और उच्च-सामग्री फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग परखका विकास शामिल है।
रिपोर्टर जीन के उपयोग ने दवा स्क्रीनिंग प्रक्रिया की दक्षता को बढ़ाने की क्षमता दिखाई है क्योंकि यह उच्च-थ्रूपुट और विवो परख के विकास की सुविधा प्रदान करता है। विभिन्न शोध समूहों द्वारा कई रिपोर्टर जीन ों को व्यक्त करने वाले पुनः संयोजक लीशमैनिया परजीवी उत्पन्न किए गए हैं। रिपोर्टर जीन, जैसे β-गैलेक्टोसिडेस, β-लैक्टामेज़, और लूसिफेरेस, एपिसोमल वैक्टर का उपयोग करके कई लीशमैनिया प्रजातियों में पेश किए गए हैं, जो परजीवी10,11,12,13,14,15 के अतिरिक्त और इंट्रा-सेलुलर रूपों में दवा स्क्रीनिंग के लिए सीमित उपयोगिता दिखाते हैं।. इन दृष्टिकोणों में एपिसोमल निर्माण के उन्मूलन से बचने के लिए संस्कृति में एक मजबूत चयनात्मक दबाव की आवश्यकता होती है, साथ ही रिपोर्टर जीन की गतिविधि को प्रकट करने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों का उपयोग भी होता है। इसके विपरीत, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और इसके संस्करण, एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) का उपयोग इन विट्रो ड्रग स्क्रीनिंग परख के लिए बड़ी संख्या में ट्रांसजेनिक लीशमैनिया उपभेदों की पीढ़ी में उनके लचीलेपन और संवेदनशीलता के साथ-साथ फ्लो साइटोमेट्री या फ्लोरोमेट्री15 का उपयोग करके स्क्रीनिंग प्रक्रिया को स्वचालित करने की संभावना के कारण किया गया है। 16,17,18,19. आशाजनक परिणामों के बावजूद, इन ट्रांसजेनिक उपभेदों की संस्कृतियां उनके प्रतिदीप्ति स्तरों में अत्यधिक विषम थीं, क्योंकि जीएफपी जीन की प्रतियों की संख्या सभी परजीवियों में समान नहीं थी। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति को बनाए रखने के लिए संस्कृति में परजीवियों पर निरंतर चयनात्मक दबाव की आवश्यकता होती है, क्योंकि जीएफपी जीन को एपिसोमल निर्माण में पेश किया गया था।
पहले बताए गए कारणों के लिए, कई प्रयासों ने स्थिर पुनः संयोजक उपभेदों के उत्पादन के लिए नई पद्धतियों को विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। इन प्रयासों ने ज्यादातर राइबोसोमल लोकी में रिपोर्टर जीन के एकीकरण पर भरोसा किया है, जो राइबोसोमल जीन20 की उच्च प्रतिलेखन दर का लाभ उठाते हैं। एल. इन्फेंटम और एल. एमेज़ोनेंसिस के उपभेदों को β-गैलेक्टोसाइडेज 21, आईएफपी 1.4, आईआरएफपी22 और टीडीटोमेटो23 के लिए जीन कोडिंग को एकीकृत करके उत्पन्न किया गया है, और दवा स्क्रीनिंग परख में उनकी उपयोगिता के लिए उनका मूल्यांकन किया गया है। डोनोवानी उपभेदों को विकसित किया गया है जो24,25 के समरूप पुनर्संयोजन के माध्यम से 18 एस राइबोसोमल आरएनए लोकस (एसएसयू लोकस) में अपने कोडिंग जीन को एकीकृत करके जीएफपी को संवैधानिक रूप से व्यक्त करते हैं; उन्होंने ट्रांसमिटेड आबादी में स्थिर और सजातीय जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाई, जिसमें इंट्रासेल्युलर एमेस्टिगोट्स 24,25 शामिल थे, और उन्हें ड्रग स्क्रीनिंगपरख 24,25,26 में सफलतापूर्वक लागू किया गया था। बोलहासनी एट अल.27 ने एल मेजर और एल इन्फेंटम के उपभेदों को विकसित किया, जो जीएफपी को एक एकीकृत ट्रांसजीन के रूप में व्यक्त करते हैं। उन्होंने एकीकरण वेक्टर pLEXSY का उपयोग किया, जिसे मूल रूप से मेजबान28 के रूप में L. tarentolae का उपयोग करके एक प्रणाली में प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के लिए डिज़ाइन किया गया था। PLEXSY-GFP वेक्टर विभिन्न लीशमैनिया उपभेदों की पीढ़ी के लिए बहुत कुशल साबित हुआ है जो जीएफपी 24,25,27,29,30 को संवैधानिक रूप से व्यक्त करता है। इन परजीवियों में, प्रतिदीप्ति सजातीय है और इंट्रासेल्युलर रूपों में बनाए रखा जाता है,संक्रमित चूहों के फुटपैड घावों में पता लगाने में सक्षम होता है।
इस काम में, हम पीएलईएक्सएसवाई प्रणाली का उपयोग करके एक एकीकृत ट्रांसजीन के रूप में ईजीएफपी के लिए जीन एन्कोडिंग को व्यक्त करने वाले एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का वर्णन करते हैं। इस प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न उपभेदों का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में दवा-स्क्रीनिंग परख करने के लिए किया जाता है जो प्राकृतिक और सिंथेटिक मूल के अणुओं की संभावित एंटी-लीशमैनिया गतिविधि का मूल्यांकन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कई प्रोटोजोआ परजीवियों में विभिन्न रिपोर्टर जीन के फायदे और नुकसान का अध्ययन किया गया है। उनमें से, जीएफपी और ईजीएफपी आंतरिक रूप से फ्लोरोसेंट हैं और आसान मात्रा और इमेजिंग की अनुमति देते हैं। इन प्रो…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सेक्रेटेरिया नेशनल डी सिएनसिया, टेक्नोलोगिया ई इनोवेसिओन (एसईएनएसीवाईटी), पनामा, अनुदान संख्या एनआई -177-2016, और सिस्तेमा नेशनल डी इन्वेस्टिगासिओन (एसएनआई), पनामा, अनुदान संख्या एसएनआई-169-2018, एसएनआई-008-2022, और एसएनआई-060-2022 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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