JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetica

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/64939
, , , , , , ,
1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades,Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo,Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia,Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)

Summary

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

Abstract

Leishmania cinsinin protozoan parazitleri, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen değişken klinik belirtilere sahip bir hastalık olan leishmaniasis’e neden olur. L. donovani enfeksiyonu ölümcül iç organ hastalığına neden olabilir. Panama, Kolombiya ve Kosta Rika’da, L. panamensis bildirilen kutanöz ve mukokutanöz leishmaniasis vakalarının çoğundan sorumludur. Bugüne kadar mevcut olan metodolojilerle çok sayıda ilaç adayını incelemek, bileşiklerin parazitin hücre içi formlarına karşı aktivitesini değerlendirmek veya in vivo tahliller yapmak için çok zahmetli oldukları göz önüne alındığında oldukça zordur. Bu çalışmada, 18S rRNA’yı (ssu) kodlayan lokusa entegre edilmiş gelişmiş bir yeşil floresan proteini (eGFP) kodlayan genin yapısal ekspresyonu ile L. panamensis ve L. donovani suşlarının oluşumunu açıklıyoruz. eGFP’yi kodlayan gen, ticari bir vektörden elde edildi ve onu zenginleştirmek ve BglII ve KpnI enzimleri için kısıtlama bölgeleri eklemek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edildi. eGFP amplisonu, agaroz jel saflaştırması ile izole edildi, BglII ve KpnI enzimleri ile sindirildi ve daha önce aynı enzim seti ile sindirilmiş Leishmania ekspresyon vektörü pLEXSY-sat2.1’e bağlandı. Klonlanmış gen ile ekspresyon vektörü E. coli’de çoğaltıldı, saflaştırıldı ve ekin varlığı koloni PCR ile doğrulandı. Saflaştırılmış plazmit doğrusallaştırıldı ve L. donovani ve L. panamensis parazitlerini transfekte etmek için kullanıldı. Genin entegrasyonu PCR ile doğrulandı. eGFP geninin ekspresyonu akım sitometrisi ile değerlendirildi. Floresan parazitler seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar akış sitometrisi kullanılarak seçildi.

Introduction

Leishmania cinsinin protozoan parazitleri, çok çeşitli klinik belirtileri olan bir hastalık olan leishmaniasis’e neden olur. Bu hastalık 98 ülkede yaygındır ve yıllık insidansının 0,9 ila 1,6 milyon vaka olduğu tahmin edilmektedir1. İnsanlar için patojenik olan Leishmania türleri, L olmak üzere iki alt türe ayrılır. (Leishmania) ve L. (Viyana). L’ye ait bazı türlerle enfeksiyon. L. donovani ve L. infantum gibi (Leishmania) alt cinsi, tedavi edilmezse ölümcül olan visseral leishmaniasis (VL) ile sonuçlanabilir2. L’ye ait türler. (Viannia) alt cinsi, Orta ve Güney Amerika’da, özellikle Panama, Kolombiya ve Kosta Rika’da çoğu kutanöz leishmaniasis (CL) ve mukokutanöz leishmaniasis (MCL) vakası ile ilişkilidir ve L. panamensis bu klinik sunumların ana etiyolojik ajanıdır 3,4.

Beş değerlikli antimonyaller, miltefosin ve amfoterisin B gibi ilaçları içeren mevcut anti-leishmania kemoterapisi oldukça toksik ve pahalıdır. Ayrıca, son yıllarda artan ilaç direnci, dünya çapında hastaların etkili tedavisine müdahale eden faktörlere eklenmiştir5. Leishmania cinsinin türleri arasında, özellikle Yeni ve Eski Dünya türleri arasında, uyuşturucuya duyarlılık ile ilgili olarak önemli farklılıklar gösterilmiştir 6,7. Bu nedenlerden dolayı, türe özgü yaklaşımlara özel önem vererek, yeni anti-leishmania ilaçlarının tanımlanması ve geliştirilmesine yönelik çabaların yönlendirilmesi gerekmektedir. Geleneksel metodolojilere sahip büyük ilaç adayı kütüphanelerini incelemek oldukça zordur, çünkü bu metodolojiler, bileşiklerin hücre içi amastigotlara karşı aktivitesini değerlendirmek veya in vivo deneyler yapmak için çok zahmetlidir8; Bu nedenle, raportör genlerin uygulanması ve yüksek içerikli fenotipik tarama testlerinin geliştirilmesi de dahil olmak üzere bu dezavantajları azaltan yeni tekniklerin geliştirilmesi gerekli olmuştur9.

Raportör genlerin kullanımı, yüksek verimli ve in vivo tahlillerin geliştirilmesini kolaylaştırdığı için ilaç tarama sürecinin etkinliğini artırma potansiyelini göstermiştir. Çeşitli araştırma grupları tarafından çeşitli raportör genleri eksprese eden rekombinant Leishmania parazitleri üretilmiştir. β-galaktosidaz, β-laktamaz ve lusiferaz gibi raportör genler, epizomal vektörler kullanılarak birkaç Leishmania türüne dahil edilmiştir ve parazitin hücre dışı ve hücre içi formlarında ilaç taraması için sınırlı fayda göstermiştir 10,11,12,13,14,15. Bu yaklaşımlar, epizomal yapının ortadan kaldırılmasını önlemek için kültürde güçlü bir seçici baskı gerektirmenin yanı sıra raportör genin aktivitesini ortaya çıkarmak için ek reaktiflerin kullanılması sınırlamasına sahiptir. Tersine, yeşil floresan proteini (GFP) ve varyantı, geliştirilmiş yeşil floresan proteini (eGFP), esneklikleri ve duyarlılıkları nedeniyle in vitro ilaç tarama deneyleri için çok sayıda transgenik Leishmania suşunun üretilmesinde kullanılmıştır, ayrıca akış sitometrisi veya florometri15 kullanarak tarama sürecini otomatikleştirme olasılığı, 16,17,18,19. Umut verici sonuçlara rağmen, bu transgenik suşların kültürleri, GFP geninin kopya sayısı tüm parazitlerde aynı olmadığından, floresan seviyelerinde oldukça heterojendi. Ayrıca, floresansın korunması, GFP geni epizomal bir yapıda sokulduğundan, kültürdeki parazitler üzerinde sürekli seçici baskı gerektiriyordu.

Daha önce belirtilen nedenlerden dolayı, birçok çaba, kararlı rekombinant suşlar üretmek için yeni metodolojiler geliştirmeye odaklanmıştır. Bu çabalar çoğunlukla, ribozomal genlerin20 daha yüksek transkripsiyon oranlarından yararlanarak, raportör genlerin ribozomal lokuslara entegrasyonuna dayanmıştır. L. infantum ve L. amazonensis suşları, β-galaktosidaz21, IFP 1.4, iRFP22 ve tdTomato23’ü kodlayan genleri entegre ederek üretilmiş ve ilaç tarama testlerinde yararlılıkları açısından değerlendirilmiştir. Çeşitli gruplar, kodlama genini homolog rekombinasyon yoluyla 18S ribozomal RNA lokusuna (ssu lokusu) entegre ederek GFP’yi yapısal olarak eksprese eden L. donovani suşları geliştirmiştir24,25; hücre içi amastigotlar 24,25 dahil olmak üzere transfekte edilmiş popülasyonda stabil ve homojen GFP ekspresyonu gösterdiler ve ilaç tarama testlerinde24,25,26 başarıyla uygulandılar. Bolhassani ve ark.27, GFP’yi entegre bir transgen olarak eksprese eden L. major ve L. infantum suşları geliştirdi. Başlangıçta konakçı28 olarak L. tarentolae kullanan bir sistemde proteinlerin transgenik ekspresyonu için tasarlanmış entegrasyon vektörü pLEXSY’yi kullandılar. pLEXSY-GFP vektörünün, GFP24,25,27,29,30’u yapısal olarak eksprese eden farklı Leishmania suşlarının üretilmesi için çok etkili olduğu gösterilmiştir. Bu parazitlerde, floresan homojendir ve hücre içi formlarda korunur, enfekte farelerin ayak tabanı lezyonlarında tespit edilebilir27.

Bu çalışmada, pLEXSY sistemini kullanarak entegre bir transgen olarak eGFP’yi kodlayan geni ifade eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Bu işlemle üretilen suşlar, laboratuvarımızda, doğal ve sentetik kökenli moleküllerin potansiyel anti-leishmania aktivitesini değerlendiren ilaç tarama testleri yapmak için kullanılır.

Protocol

Numuneleri steril tutmak için, parazit kültürünü içeren tüm adımlar bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) başlığı içinde veya yerel sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine göre gerçekleştirilmelidir. Bu protokolün grafiksel bir özeti Şekil 1’de bulunabilir. Şekil 1: pLEXSY-2.1 vekt?…

Representative Results

pLEXSY-eGFP yapısını oluşturduktan ve yetkin E. coli hücrelerini dönüştürdükten sonra, yapıyı eGFP eki ile içeren koloniler, bölüm 1.2’de açıklanan koloni PCR’sini çalıştırdıktan sonra yaklaşık 859 bp’lik bir ürün üretecektir (Şekil 3A). SwaI kullanılarak pozitif kolonilerden saflaştırılmış plazmitin toplam sindirimi, jel elektroforezinde iki karakteristik fragman, PLEXSY vektörünün E. coli’de replikasyon ve seçim için gerekli tüm ele…

Discussion

Çeşitli raportör genlerin avantajları ve dezavantajları çeşitli protozoan parazitlerde incelenmiştir. Bunlar arasında, GFP ve eGFP doğası gereği floresandır ve kolay miktar belirleme ve görüntülemeye izin verir. Bu proteinlerin floresan aktivitesi, floresan mikroskobu, florimetri veya akış sitometrisi kullanılarak minimum manipülasyon ile tespit edilebilir. GFP eksprese eden L üretmek için çok az çalışma yapılmıştır. (Viannia) suşları, GFP ve türevlerinin Eski Dünya <em…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panama, NI-177-2016 hibe numarası ve Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panama, hibe numaraları SNI-169-2018, SNI-008-2022 ve SNI-060-2022 tarafından finanse edilmiştir.

Materials

96 Well Microplates Corning CLS3340 Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose Sigma-Aldrich A4718
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A8351 BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme New England BioLabs R0144S 2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks Corning CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001401
CyFlow Space Sysmex Not available
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021 powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F7524
Gel Loading Buffer Sigma-Aldrich G2526  The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System Bio-Rad 1652660 The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes Bio-Rad 1652086 Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution Sigma-Aldrich G1397 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix Promega M4021
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope Olympus IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme New England BioLabs R3142S 4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar Sigma-Aldrich L3147 Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth  Sigma-Aldrich L2542 Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio-Rad 1640300 Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x Addgene 172281 Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit Jena Bioscience EGE-1310sat Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride Millipore 529552 Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222 Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium Sigma-Aldrich S0146 Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich RDD038 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme New England BioLabs R0604S 2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters Corning CLS431212 regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase Promega M1801 Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415 BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
  3. Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
  4. Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
  5. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  6. Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
  7. Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
  8. Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
  9. Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
  10. Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
  11. Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
  12. Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
  13. Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
  14. Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
  15. Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
  16. Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
  17. Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
  18. Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
  19. Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
  20. Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
  21. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  22. Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
  23. García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
  24. Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
  25. De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  26. Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
  27. Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
  28. Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
  29. Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
  30. Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
  31. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
  32. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  33. Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , (2012).
  34. Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
  35. Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
  36. Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
  37. Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
  38. Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).

Tags

LeishmaniaEGFPHigh-throughput ScreeningPCRCloningPlasmidTransfectionParasite Culture
check_url/it/64939?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Carrasco, J., Chang, J. H., Pineda, L., Quintero, I., Giovani, R., Spadafora, C., Lleonart, R., Restrepo, C. M. Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP. J. Vis. Exp. (194), e64939, doi:10.3791/64939 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image