यह प्रोटोकॉल उनके मेजबानों पर प्रोफेज के प्रभाव को प्रकट करने में सक्षम बनाता है। बैक्टीरियल संस्कृतियों को उन स्थितियों का उपयोग करके सिंक्रनाइज़ किया जाता है जो लाइसोजेनिक स्थिति का सबसे अच्छा समर्थन करते हैं, सहज प्रेरण को सीमित करते हैं। आरटी-क्यूपीसीआर स्पष्ट रूप से प्रोफेज-प्रतिबंधित जीन और फेज नियंत्रण से अयुग्मित जीन को उन लोगों से अलग करता है जो लिटिक प्रतिकृति चक्र के दौरान व्यक्त किए जाते हैं।
समशीतोष्ण फेज बैक्टीरिया जीनोम के बहुमत में प्रोफेज के रूप में एकीकृत पाए जाते हैं। कुछ प्रोफेज बैक्टीरियल क्रोमोसोम में क्रिप्टिक और फिक्स्ड होते हैं, लेकिन अन्य सक्रिय होते हैं और उन्हें अनायास या उत्प्रेरण कारकों के संपर्क में आने से प्रतिकृति रूप में ट्रिगर किया जा सकता है। प्रोफेज आमतौर पर अपने मेजबान सेल पर विष उत्पादन या अन्य विषाणु से जुड़े लक्षणों को प्रदान करने की क्षमता से जुड़े होते हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वे अपने मेजबानों के शरीर विज्ञान को बदलने में बहुत बड़ी भूमिका निभा सकते हैं। यहां वर्णित तकनीक ने हमें यह जांचने में सक्षम बनाया है कि कैसे प्रोफेज अवसरवादी जीवाणु स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं।
इस काम में, जंगली-प्रकार पी एरुगिनोसा स्ट्रेन पीएओ 1 के विकास की तुलना लिवरपूल एपिडेमिक स्ट्रेन (एलईएस) एलईएसबी 58 से प्रोफेज के विभिन्न संयोजनों को ले जाने वाले इसोजेनिक लाइसोजेन्स के साथ की गई थी। एक लाइसोजेन संस्कृति में, जीवाणु कोशिकाओं का एक अनुपात लिटिक बैक्टीरियोफेज प्रतिकृति (सहज प्रेरण) का समर्थन करेगा, जिसमें देर से फेज जीन के प्रति कोशिका अभिव्यक्ति का उच्च स्तर होगा, जैसे कि फेज कणों की असेंबली से जुड़े, इस प्रकार लाइसोजेन-प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति से जुड़े निम्न-स्तरीय जीन अभिव्यक्ति को छिपाना। सहज प्रेरण का प्रभाव इस प्रकार एक लाइसोजेन आबादी में प्रोफेज जीन अभिव्यक्ति को अस्पष्ट कर सकता है।
विकास प्रोफाइलिंग प्रयोगों का उपयोग सहज प्रेरण की पहचान करने के लिए किया गया था, जो प्रारंभिक घातीय विकास चरण के दौरान न्यूनतम था। यह अध्ययन बताता है कि प्रारंभिक घातीय विकास चरण के दौरान नमूना संस्कृतियों को कैसे तैयार किया जाए और कम सेल संख्या के बावजूद पर्याप्त नियंत्रण कैसे स्थापित किया जाए। ये प्रोटोकॉल विभिन्न परिस्थितियों में जंगली-प्रकार और लाइसोजेनिक बैक्टीरिया की विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तुलना सुनिश्चित करते हैं, इस प्रकार प्रोफेज जीनोम के ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग में सुधार करते हैं और पहले से पहचाने गए प्रोफेज कार्यों की पहचान में सहायता करते हैं।
हाल ही में, रोगाणुरोधी प्रतिरोध1 और सीआरआईएसपीआर-सीएएस-आधारित जीन संपादन2 से निपटने के लिए फेज थेरेपी ने बैक्टीरियोफेज अनुसंधान में नए सिरे से रुचि पैदा की है। फिर, जैव प्रौद्योगिकी में प्रगति ने बैक्टीरिया और फेज3 के बीच बातचीत की गहरी जांच को सक्षम किया है। हालांकि, फेज (“फेज थेरेपी”) का चिकित्सीय उपयोग फेज के बारे में चिंताओं से बाधित होता है जो मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के रूप में कार्य करते हैं, जिसमें विषाणु और प्रतिरोध जीन कोक्षैतिज रूप से स्थानांतरित करने की क्षमता होती है। “डार्क मैटर” 5 (अज्ञात कार्यों वाले जीन) का विस्तार परेशान और मोहक दोनों है। डार्क मैटर को फेज जीव विज्ञान की हमारी समझ में एक अंतर माना जाता है और आणविक उपकरणों और संभावित नवीन चिकित्सीय 6 के लिए काफी हद तक अप्रयुक्त संसाधनहै। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों का विकास, बेहतर जीन एनोटेशन 7,8,9 और नए पेप्टाइड-फोल्डिंग एल्गोरिदम10 के साथ, फेज जीन का पता लगाने, विवरण और कार्यात्मक भविष्यवाणी में सुधार कर रहा है। हालांकि, विज्ञान अभी भी संस्कृति या वास्तविक दुनिया में अधिकांश फेज के जीन कार्यों को मान्य करने से बहुत दूर है।
आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) विश्व स्तर पर फेज संक्रमण के दौरान जीन अभिव्यक्ति को मैप कर सकता है और लिटिक और लाइसोजेनिक चक्र11,12 में शामिल फेज और जीवाणु तत्वों दोनों की समझ में काफी सुधार हुआ है। लाइसोजेनिक प्रक्रियाओं के दौरान, समशीतोष्ण फेज जीनोम को बैक्टीरिया डीएनए में एकीकृत किया जाता है ताकि प्रोफेज13 बन सकें। वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग प्रयोगों का उपयोग प्रोफेज-प्रतिबंधित जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो समशीतोष्ण फेज जीनोम पर एन्कोड किए गए हैं लेकिन केवल लाइसोजेनिक अवस्था11 के दौरान व्यक्त किए गए हैं। ऐसे जीन फेज संरचनात्मक प्रोटीन को एन्कोड नहीं करते हैं और किसी भी फेज संक्रमण प्रक्रियाओं में शामिल नहीं होते हैं। आरएनए-सेक का उपयोग उन जीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो बैक्टीरिया के मेजबान के जीव विज्ञान को प्रभावित करने की अधिक संभावना रखते हैं, या तो कार्य के लाभ को प्रेरित करके या मौजूदा जीवाणु जीन को विनियमित करके, इस प्रकार अक्सर बैक्टीरिया को बदलते वातावरण के अनुकूल बनाने में सक्षम बनाते हैं। इसलिए, बैक्टीरिया के कार्यों की एक श्रृंखला को नियंत्रित करते हुए, माइक्रोबियल कठपुतली स्वामी के रूप में कार्य करने के लिए प्रोफेज की क्षमता का अध्ययन किया जा सकता है।
प्रोफेज-प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति के प्रभावी विश्लेषण के लिए दो प्रमुख बाधाएं हैं। सबसे पहले, अतिसंवेदनशील मेजबानों की उपलब्धता एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। परिभाषा के अनुसार, प्रोफेज पहले से ही अपने विशिष्ट मेजबान जीनोम में शामिल हैं, इसलिए प्रोफेज की उपस्थिति और अनुपस्थिति में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए अतिसंवेदनशील जंगली-प्रकार के मेजबान को ढूंढना चुनौतीपूर्ण है। यह या तो किसी अन्य अतिसंवेदनशील मेजबान के डे नोवो संक्रमण के माध्यम से या मूल जंगली-प्रकार के अलगाव से प्रोफेज के विलोपन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, बाकी मेजबान जीनोम को बाधित किए बिना। दूसरी बाधा लाइसोजेनिक आबादी की विषम प्रकृति में निहित है। कुछ प्रोफेज उत्परिवर्तन या पुनर्संयोजन के माध्यम से “क्रिप्टिक” बनने के लिए अवक्रमित होते हैं, जिसका अर्थ है कि वे बैक्टीरिया जीनोम के एक विशिष्ट स्थान पर तय होते हैं। हालांकि, अन्य प्रोफेज “सक्रिय” होते हैं और उन्हें अनायास या उत्प्रेरण कारकों के संपर्क में आने के बाद एक प्रतिकृति, लिटिक चक्र में प्रेरित किया जा सकता है। कई लाइसोजेनिक संस्कृतियों में, सहज प्रेरण की दर का मतलब है कि बैक्टीरिया कोशिकाओं का एक अनुपात हमेशा लिटिक फेज प्रतिकृति14,15,16 से गुजर रहा है। इन आबादी में देर से फेज जीन की अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर लाइसोजेन-प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति11,17 से जुड़े निम्न-स्तरीय जीन अभिव्यक्ति को मुखौटा करता है। सहज प्रोफेज प्रेरण से गुजरने वाले लाइसोजेन्स का अनुपात विकास की स्थिति, विकास की स्थिति या अन्य ट्रिगर्स के साथ भिन्न हो सकता है। इसलिए, लाइसोजेन पर प्रोफेज के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, लाइसोजेनिक स्थिति के पक्ष में विकास की स्थिति को अनुकूलित करके सहज प्रोफेज प्रेरण घटनाओं को यथासंभव कम किया जाना चाहिए।
यह अध्ययन स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिवरपूल एपिडेमिक स्ट्रेन (एलईएस) से सहवास प्रोफेज के एक सेट के प्रभाव की जांच करने के लिए किए गए प्रारंभिक कार्य की रिपोर्ट करता है। सक्रिय प्रोफेज को एलईएस से प्रेरित और अलग किया गया था और मॉडल पी एरुगिनोसा होस्ट स्ट्रेन, पीएओ 116,18,19 को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया गया था। एरुगिनोसा स्ट्रेन, पीएओ 1, और इसके लाइसोजेन, पीएओ 1 : 2 के पूरे जीनोम को अनुक्रमित किया गया था (30 x कवरेज की गहराई पर) ताकि जंगली प्रकार के तनाव की पहचान सुनिश्चित की जा सके और यह पुष्टि की जा सके कि लाइसोजेन इसोजेनिक था। एलईएस को सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों में रुग्णता और मृत्यु दर में वृद्धि के साथ जोड़ा गया है, और एलईएस फेज19 को सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों के वातावरण 16,19,20 के अनुकूलन में सहायता करने का सुझाव दिया गया है। मजबूत सबूत के बावजूद कि ये प्रोफेज अपने मेजबान20,21 के जीव विज्ञान को प्रभावित करते हैं, उनके अधिकांश जीन कार्यों को अभी तक विशेषता नहीं दी गई है, और बातचीत के विशिष्ट तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है। एक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स दृष्टिकोण एक नियंत्रित मेजबान पृष्ठभूमि में प्रोफेज जीन कार्यों को अनुभवपूर्वक उजागर कर सकता है। चूंकि सहज प्रेरण अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रभावित कर सकता है, इसलिए यह लेख बताता है कि लाइसोजेनिक स्थिति के पक्ष में विकास की स्थिति को कैसे अनुकूलित किया जाए। संस्कृतियों के इस तरह के सिंक्रनाइज़ेशन को वास्तविक समय पीसीआर द्वारा प्रमुख आनुवंशिक मार्करों के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए मान्य किया जा सकता है जो पीएओ 1 में एलईएस फेज प्रतिकृति के महत्वपूर्ण चरणों से जुड़े हैं। इसी दृष्टिकोण का उपयोग पहले शिगा-टॉक्सोजेनिक फेज के प्रोफेज-प्रतिबंधित कार्यों की पहचान करने के लिए किया गया है जो एस्चेरिचिया कोलाई 11,17,21,22 में गतिशीलता, एसिड प्रतिरोध और रोगाणुरोधी प्रतिरोध को प्रभावित करते हैं।
ई कोलाई एमसी 106137,38,39 से एसटीएक्स फेज के सहज प्रेरण को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए पट्टिका परख में उपयोग किए जाने वाले एक चयन योग्य संकेतक मेजबान का निर्माण यहां पी एरुगिनोसा फेज लेस2 के लिए वर्णित किया गया है। इस हस्तक्षेप में नमूना प्रसंस्करण चरणों और समय को कम करने का अतिरिक्त लाभ है, इस प्रकार कई संस्कृति स्थितियों में सहज प्रेरण दरों के एक साथ मूल्यांकन को सक्षम किया जा सकता है। रिफैम्पिसिन-प्रतिरोधी वेरिएंट40 के निर्माण के दौरान अन्य उत्परिवर्तन उत्पन्न करने का खतरा है; हालांकि, इस काम में, विकसित तनाव का उपयोग केवल रुचि की संस्कृतियों से सजीले टुकड़े की गणना के लिए एक संकेतक मेजबान के रूप में किया गया था और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया था। जब तक चयन योग्य संकेतक तनाव रुचि के फेज द्वारा संक्रमण के लिए समान रूप से अतिसंवेदनशील रहता है, तब तक अन्य अधिग्रहित उत्परिवर्तनों के बारे में कोई चिंता नहीं है। फिर भी, पीएओ 1डब्ल्यूटी और पीएओ 1आरआईएफ (डेटा नहीं दिखाया गया) के पल्स फील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन (पीएफजीई) विश्लेषण द्वारा प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता प्रोफाइल में कोई अंतर नहीं पाया गया था।
मेजबान कोशिकाओं को चुनते समय, एक संकेतक तनाव ढूंढना दुर्लभ है जो पहले से ही प्रोफेज को परेशान नहीं करता है। बिंदु में एक मामले के रूप में, पीएओ 1 फिलामेंटस प्रोफेज पीएफ 4 को परेशान करता है। इस अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक नियंत्रण ों को विशिष्ट फेज (इस मामले में, एलईएस प्रोफेज 2) की जीन अभिव्यक्ति और बैक्टीरिया जीन अभिव्यक्ति पर इस फेज के प्रभावों की सीधे जांच करने में सक्षम होने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एलईएस प्रोफेज 2 ले जाने वाले पीएओ 1 से प्रतिलिपियों की तुलना में और एलईएस प्रोफेज 2 (लाइसोजेन और गैर-लाइसोजेन दोनों अंतर्जात पीएफ 4 ले जाते हैं), जो मेजबान पर पीएफ 4 के प्रभाव को बाहर करने के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया गया है कि पीएफ 4 आमतौर पर अपने मेजबान सेल41 में लाइसिस का कारण नहीं बनता है और इसलिए, इन प्रयोगों के परिणामों को भ्रमित करने में सक्षम नहीं है।
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि सार्थक ओमिक्स डेटा42 के उत्पादन के लिए नमूना तैयारी में सावधानीपूर्वक गुणवत्ता नियंत्रण महत्वपूर्ण है। हालांकि, जैसा कि पहले11 वर्णित है, ऐसे अध्ययनों के लिए लाइसोजेन संस्कृतियों की तैयारी में प्रोफेज गतिविधि का सावधानीपूर्वक लक्षण वर्णन शायद ही कभी किया जाता है। यहां, हम बैक्टीरिया और समशीतोष्ण फेज के बीच बातचीत का बेहतर पता लगाने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन के लिए संस्कृतियों के एक अच्छी तरह से नियंत्रित और अनुकूलित सेट तैयार करने के लिए हमारे व्यवस्थित प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। आबादी की समकालिकता को प्रेरित एंटीबायोटिक नॉरफ्लॉक्सासिन के साथ इलाज करने से पहले संस्कृति को कम से कम चार दोहरीकरण के माध्यम से लाकर नियंत्रित किया गया था। अध्ययन में तनाव के लिए नॉरफ्लॉक्सासिन के एमआईसी का निर्धारण करके, हम यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि उत्प्रेरण एजेंट की एकाग्रता “प्रेरण” उपचार के लिए एमआईसी से ठीक ऊपर थी। उपचारित कोशिकाओं को 1 घंटे के उपचार के बाद एमआईसी के नीचे नॉरफ्लॉक्सासिन एकाग्रता को कम करने के लिए 1:10 पतला किया गया था ताकि कोशिकाओं को फेज प्रतिकृति प्रक्रिया को ठीक करने और पूरा करने की अनुमति मिल सके, सेल के लाइसिस में समाप्त हो सके और संक्रामक फेज संतान की रिहाई हो सके। कोशिकाएं केवल प्रेरण उत्तेजना के बाद लिटिक प्रतिकृति चक्र में प्रवेश करती हैं जब रिकवरी अवधि के दौरान नॉरफ्लॉक्सासिन की एकाग्रता एमआईसी से नीचे लाई जाती है। इस मामले में, 1 μg.mL-1 नॉरफ्लॉक्सासिन से ऊपर जाने का मतलब है कि दवा को एमआईसी के नीचे प्रभावी रूप से पतला नहीं किया जा सकता है, क्योंकि PAO1 के लिए नॉरफ्लॉक्सासिन के लिए एमआईसी 0.19 μg.mL-1 है। इंड्यूसर कमजोर पड़ने के स्तर को लाइसोजेन रिकवरी की आवश्यकता और आरएनए की कटाई के लिए संस्कृति घनत्व के प्रतिधारण के साथ संतुलित किया जाना चाहिए। यहां चर्चा किए गए डेटा से पता चलता है कि नमूने बनाने के लिए संस्कृतियों को सिंक्रनाइज़ करना संभव है जिसमें लाइसोजेनी हावी है, इस प्रकार सहज प्रेरण से शोर को कम करता है और जीन अभिव्यक्ति में सच्चे लाइसोजेनी-संचालित परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। चूंकि लाइसोजेनिक अवस्था विकास के प्रारंभिक-घातीय चरण में प्रमुख होती है जब जीवाणु कोशिका घनत्व कम होता है, इसलिए हम आरएनए-सेक जैसे बाद के जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों के लिए पर्याप्त आरएनए की कटाई के लिए संस्कृतियों को बढ़ाने का सुझाव देते हैं।
लिटिक चक्र में संस्कृतियों को मजबूर करने के लिए एक उत्प्रेरण एजेंट के रूप में नॉरफ्लॉक्सासिन का उपयोग अच्छी तरह से रिपोर्ट किया गया है43,44; हालांकि, यह प्रक्रिया45,46 में अन्य जीवाणु जीन की अभिव्यक्ति को भी प्रभावित करेगा। इसे कम करने के लिए, एक ही उत्प्रेरण और गैर-उत्प्रेरण स्थितियों के तहत उगाए गए जंगली प्रकार की संस्कृतियों को नियंत्रित करने वाले आरएनए पुस्तकालयों को आरएनए-सेक प्रयोगों में शामिल किया जाना चाहिए। क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा फेज प्रतिकृति के चरणों को मान्य करने के लिए आंतरिक नियंत्रण और प्रमुख मार्कर जीन का उपयोग भी सटीक तुलना के लिए महत्वपूर्ण है। मात्रात्मक आरटी-पीसीआर प्रोफाइलिंग की व्याख्या विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रत्येक जीन के लिए प्रतिलेख की पूर्ण संख्या की तुलना करके नहीं की जा सकती है; यह प्रोफ़ाइल का आकार है जो मायने रखता है। सबसे पहले, किसी भी जीन के लिए प्रतिलेख में केवल एक छोटे से क्षेत्र का नमूना लिया गया है, इसलिए क्या यह अल्पकालिक या लंबे समय तक रहने वाला तत्वहै, यह अज्ञात है। निश्चित रूप से, प्रतिलेख के आरएनए-सेक मैपिंग से पता चलता है कि मैपिंग डेटा का घनत्व जीन की लंबाई में काफी भिन्न होता है। दूसरे, यह जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का आकार है जिसे लिटिक चक्र या लाइसोजेनिक जीवन शैली से जुड़े मार्कर जीन के लिए व्याख्या की जानी चाहिए या यहां तक कि फेज नियामक सर्किट11 से भी अयुग्मित किया जाना चाहिए। लाइसोजेन संस्कृति में सहज प्रेरण एक वास्तविक मुद्दा है और इसके परिणामस्वरूप हमेशा लिटिक चक्र से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति होगी। हालांकि, प्रोफाइलिंग से पता चलता है कि लिटिक प्रतिकृति चक्र से जुड़े जीन उनकी अभिव्यक्ति पूर्व-प्रेरण (कम से कम दो लॉग फोल्ड) और अप-विनियमित पोस्ट-प्रेरण में दबा दिए जाते हैं।
कोलाई के साथ एसटीएक्स फेज इंटरैक्शन के पहले आयोजित ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण लाइसोजेनी को बनाए रखने और लिटिक चक्र11,17 को ट्रिगर करने में शामिल फेज जीन की पूरी तरह से समझ का समर्थन करते हैं। वर्तमान में, पी एरुगिनोसा के एलईएस फेज को एनोटेट किया गया है, लेकिन उनके प्रमुख जीन कार्यों को कम अच्छी तरह से समझा जाता है। ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन एलईएस प्रोफेज के पुन: एनोटेशन को सक्षम करेगा और लाइसोजेनी और लिटिक चक्र में शामिल जीन की हमारी समझ में सुधार करेगा। जीन अनुक्रम को फ़ंक्शन से जोड़ना उपन्यास प्रोफेज के अध्ययन में एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, जो बेहतर एनोटेशन टूल47 के उत्पादन के लिए फेज जीन कार्यों की पुष्टि करने के लिए अधिक अध्ययन की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। इस वीडियो लेख में विस्तृत प्रोटोकॉल और अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के व्यापक अनुप्रयोग और अनुकूलन से विभिन्न प्रोफेज कार्यों का अनावरण करने में मदद मिल सकती है और इस प्रकार, एनोटेशन पाइपलाइनों में सुधार हो सकता है और फेज और जीवाणु जीव विज्ञान की हमारी समझ बदल सकती है।
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |