Denne protokollen gjør det mulig å avsløre virkningen av profager på vertene. Bakteriekulturer synkroniseres ved hjelp av forhold som best støtter den lysogene tilstanden, og begrenser spontan induksjon. RT-qPCR skiller utvetydig profagbegrensede gener og de som ikke er koblet fra fagkontroll fra de som uttrykkes under den lytiske replikasjonssyklusen.
Tempererte fager finnes integrert som profager i de fleste bakteriegenomer. Noen profager er kryptiske og faste i bakteriekromosomet, men andre er aktive og kan utløses i en replikerende form enten spontant eller ved eksponering for induserende faktorer. Profager er ofte forbundet med evnen til å gi toksinproduksjon eller andre virulensassosierte egenskaper på vertscellen. Nyere studier har vist at de kan spille en mye større rolle i å endre fysiologien til vertene sine. Teknikken beskrevet her har gjort det mulig å undersøke hvordan profager påvirker genuttrykk i den opportunistiske bakterien Pseudomonas aeruginosa.
I dette arbeidet ble veksten av villtype P. aeruginosa-stammen PAO1 sammenlignet med veksten av isogene lysogener som bærer forskjellige kombinasjoner av profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. I en lysogenkultur vil en andel bakterieceller støtte lytisk bakteriofagreplikasjon (spontan induksjon) med et høyt ekspresjonsnivå per celle av sene faggener, slik som de som er forbundet med samlingen av fagpartikler, og dermed maskere genuttrykket på lavt nivå assosiert med lysogenbegrenset genuttrykk. Virkningen av spontan induksjon kan dermed skjule profaggenuttrykk over en lysogenpopulasjon.
Vekstprofileringseksperimenter ble brukt for å identifisere spontan induksjon, som var minimal i den tidlige eksponentielle vekstfasen. Denne studien rapporterer hvordan man forbereder prøvekulturer i den tidlige eksponentielle vekstfasen og hvordan man setter opp tilstrekkelige kontroller til tross for lave celletall. Disse protokollene sikrer pålitelig og reproduserbar sammenligning av villtype og lysogene bakterier under forskjellige forhold, og forbedrer dermed transkriptomisk profilering av profaggenomer og hjelper til med identifisering av tidligere ukjente profagfunksjoner.
Nylig har fagterapi for å takle antimikrobiell resistens1 og CRISPR-Cas-basert genredigering2 generert fornyet interesse for bakteriofagforskning. Igjen har fremskritt innen bioteknologi muliggjort dypere undersøkelse av samspillet mellom bakterier og fager3. Imidlertid hindres terapeutisk bruk av (“fagterapi”) av bekymringer om fager som fungerer som mobile genetiske elementer med kapasitet til å overføre virulens- og resistensgener horisontalt4. Utbredelsen av “mørk materie”5 (gener med ukjente funksjoner) er både urovekkende og fristende. Mørk materie regnes som et gap i vår forståelse av fagbiologi og en stort sett uutnyttet ressurs for molekylære verktøy og potensiell ny terapi6. Utviklingen av sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning, sammen med forbedret genannotasjon 7,8,9 og nye peptidfoldingsalgoritmer10, forbedrer deteksjon, beskrivelse og funksjonell prediksjon av faggener. Imidlertid er vitenskapen fortsatt langt fra å validere de fleste fagers genfunksjoner i kultur eller i den virkelige verden.
RNA-sekvensering (RNA-Seq) kan globalt kartlegge genuttrykk under faginfeksjon og har betydelig forbedret forståelsen av både- og bakterieelementene involvert i lytiske og lysogene sykluser11,12. Under lysogene prosesser blir tempererte faggenomer integrert i bakterielt DNA for å bli profager13. Globale genuttrykksprofileringseksperimenter kan brukes til å identifisere profagbegrensede gener som er kodet på tempererte faggenomer, men bare uttrykt under den lysogene tilstanden11. Slike gener koder ikke fagstrukturelle proteiner og er ikke involvert i noen faginfeksjonsprosesser. RNA-Seq kan brukes til å identifisere de gener som er mer sannsynlig å påvirke bakterievertens biologi, enten ved å indusere en gevinst av funksjon eller regulere de eksisterende bakterielle gener, og dermed ofte gjøre det mulig for bakteriene å tilpasse seg skiftende miljøer. Derfor kan profagens evne til å fungere som mikrobielle dukkemestere, som kontrollerer en rekke bakterielle funksjoner, studeres.
Det er to store barrierer for effektiv analyse av profagbegrenset genuttrykk. For det første er tilgjengeligheten av mottakelige verter et sentralt problem. Per definisjon er profager allerede innlemmet i deres spesifikke vertsgenom, så det er utfordrende å finne en mottakelig villtypevert for å sammenligne det globale genuttrykket i nærvær og fravær av profagen. Dette kan oppnås enten gjennom de novo-infeksjon av en annen mottakelig vert eller sletting av profagen fra det opprinnelige villtypeisolatet, uten å forstyrre resten av vertsgenomet. Den andre barrieren ligger i den heterogene naturen til lysogene populasjoner. Noen profager nedbrytes gjennom mutasjon eller rekombinasjon for å bli “kryptiske”, noe som betyr at de er festet på et bestemt sted av bakteriegenomet. Imidlertid er andre profager “aktive” og kan induseres til en repliktiv, lytisk syklus spontant eller etter eksponering for induserende faktorer. I mange lysogene kulturer betyr frekvensen av spontan induksjon at en andel av bakteriecellene alltid gjennomgår lytisk fagreplikasjon14,15,16. Et høyt ekspresjonsnivå av senfaggener i disse populasjonene maskerer genuttrykket på lavt nivå assosiert med lysogenbegrenset genuttrykk11,17. Andelen lysogener som gjennomgår spontan profaginduksjon kan variere med veksttilstand, vekstbetingelser eller andre utløsere. Derfor, for å studere virkningen av profager på lysogenet, må spontane profaginduksjonshendelser minimeres så mye som mulig ved å optimalisere vekstforholdene for å favorisere den lysogene tilstanden.
Denne studien rapporterer det forberedende arbeidet som er gjort for å undersøke påvirkningen av et sett med samboende profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) av Pseudomonas aeruginosa. Aktive profager ble indusert og isolert fra LES og brukt til å infisere modellen P. aeruginosa vertsstamme, PAO116,18,19. Hele genomet av villtype P. aeruginosa-stammen, PAO1, og dens lysogen, PAO1Φ2, ble sekvensert (i en dybde på 30x dekning) for å sikre identiteten til villtypestammen og for å bekrefte at lysogenet var isogent. LES har vært assosiert med økt sykelighet og dødelighet hos pasienter med cystisk fibrose, og LES-fager 19 har blitt foreslått for å hjelpe tilpasning til cystisk fibrose lungemiljø16,19,20. Til tross for sterke bevis på at disse profagene påvirker biologien til verten20,21, er flertallet av deres genfunksjoner ennå ikke karakterisert, og de spesifikke mekanismene for interaksjon er dårlig forstått. En transkriptomisk tilnærming kan empirisk avdekke profaggenfunksjonene i en kontrollert vertsbakgrunn. Siden spontan induksjon kan påvirke ekspresjonsprofiler, beskriver denne artikkelen hvordan vekstbetingelsene kan optimaliseres for å favorisere den lysogene tilstanden. Slik synkronisering av kulturer kan valideres ved sanntids PCR for å kvantifisere ekspresjonsnivåene av viktige genetiske markører som er assosiert med viktige stadier av LES-fagreplikasjon i PAO1. Den samme tilnærmingen har blitt brukt tidligere for å identifisere de profagbegrensede funksjonene til Shiga-toksigene fager som påvirker motilitet, syreresistens og antimikrobiell resistens i Escherichia coli11,17,21,22.
Opprettelsen av en valgbar indikatorvert, tidligere brukt i plakkanalyser for mer nøyaktig å kvantifisere spontan induksjon av Stx-fra E. coli MC106137,38,39, er beskrevet her for P. aeruginosa- LESΦ2. Denne intervensjonen har den ekstra fordelen av å redusere prøvebehandlingstrinnene og -tiden, og muliggjør dermed samtidig vurdering av spontane induksjonshastigheter ved flere kulturforhold. Det er fare for å generere andre mutasjoner under opprettelsen av rifampicinresistente varianter40; I dette arbeidet ble imidlertid den utviklede stammen bare brukt som indikatorvert for oppregning av plakk fra kulturer av interesse og ble ikke inkludert i den transkriptomiske analysen. Så lenge den valgbare indikatorstammen forblir like utsatt for infeksjon av fagen av interesse, er det ingen bekymring for andre ervervede mutasjoner. Likevel ble det ikke påvist forskjeller i restriksjonsfragmentlengdepolymorfismeprofilene ved analyse av pulsfeltgelelektroforese (PFGE) av PAO1WT og PAO1RIF (data ikke vist).
Når du velger vertsceller, er det sjelden å finne en indikatorstamme som ikke allerede har profager. Som et eksempel på dette har PAO1 den trådformede profagen Pf4. De eksperimentelle kontrollene for denne studien ble designet for å kunne direkte undersøke genuttrykket av spesifikke fager (i dette tilfellet LES prophage 2) og effektene denne fagen har på bakteriell genuttrykk. I sammenligningen av transkripsjoner fra PAO1 som bærer LES prophage 2 og mangler LES prophage 2 (både lysogen og ikke-lysogen bærer den endogene Pf4), som tjener som internkontroll for å utelukke virkningen av Pf4 på verten. I tillegg har det blitt påvist at Pf4 vanligvis ikke forårsaker lysis i vertscellen41 og derfor ikke er i stand til å forvirre resultatene av disse eksperimentene.
Det er veletablert at nøye kvalitetskontroll er avgjørende i prøveforberedelse for å produsere meningsfulle omics-data42. Imidlertid, som tidligere beskrevet11, utføres sjelden forsiktig karakterisering av profagaktivitet ved fremstilling av lysogenkulturer for slike studier. Her beskriver vi våre systematiske protokoller for å forberede et godt kontrollert og optimalisert sett med kulturer for transkriptomiske studier for bedre å utforske samspillet mellom bakterier og tempererte fager. Synkroniseringen av befolkningen ble kontrollert ved å bringe kulturen gjennom minst fire doblinger før den ble behandlet med det induserende antibiotikumet norfloxacin. Ved å bestemme MIC for norfloxacin for stammen i studien, kunne vi sikre at konsentrasjonen av induksjonsmidlet var like over MIC for “induksjon” -behandlingen. De behandlede cellene ble deretter fortynnet 1:10 for å senke norfloxacinkonsentrasjonen under MIC etter 1-timers behandling for å tillate cellene å gjenopprette og fullføre fagreplikasjonsprosessen, som endte i lysis av cellen og frigjøring av infeksiøs fagavkom. Cellene går bare inn i den lytiske replikasjonssyklusen etter induksjonsstimulansen når konsentrasjonen av norfloxacin er brakt under MIC i gjenopprettingsperioden. I dette tilfellet betyr det å gå over 1 μg·ml−1 norfloksacin at legemidlet ikke effektivt kunne fortynnes under MIC, da MIC for norfloxacin for PAO1 er 0,19 μg·ml−1. Nivået av induktorfortynning må balanseres med behovet for lysogenutvinning og oppbevaring av kulturtettheten for høsting av RNA. Dataene som diskuteres her, viser at det er mulig å synkronisere kulturer for å lage prøver der lysogeni dominerer, og dermed redusere støyen fra spontan induksjon og muliggjøre påvisning av sanne lysogenidrevne endringer i genuttrykk. Siden den lysogene tilstanden er dominerende i den tidlige eksponentielle vekstfasen når bakteriecelletettheten er lav, foreslår vi å skalere opp kulturene for å høste nok RNA til påfølgende genuttrykksstudier som RNA-Seq.
Bruken av norfloxacin som et induserende middel for å tvinge kulturer inn i lytisk syklus er godt rapportert43,44; Dette vil imidlertid også påvirke uttrykket av andre bakteriegener i prosessen45,46. For å redusere dette, bør RNA-biblioteker fra kontrollkulturer av villtype dyrket under de samme induserende og ikke-induserende forholdene inkluderes i RNA-Seq-eksperimenter. Bruken av interne kontroller og nøkkelmarkørgener for å validere stadiene av fagreplikasjon ved qRT-PCR er også avgjørende for nøyaktige sammenligninger. Kvantitativ RT-PCR-profilering kan ikke tolkes ved å sammenligne det absolutte antall transkripsjoner for hvert gen på forskjellige tidspunkter; Det er formen på profilen som betyr noe. For det første har bare en liten region i transkripsjonen for noe gen blitt samplet, så om det er et kortvarig eller mer langvarig element er ukjent27. Riktignok viser RNA-Seq-kartlegging av transkripsjoner at tettheten av kartleggingsdataene varierer betydelig over lengden av et gen. For det andre er det formen på genuttrykksprofilen som skal tolkes for et markørgen assosiert med den lytiske syklusen eller den lysogene livsstilen eller til og med frakoblet fra fagreguleringskretsene11. Spontan induksjon er et reelt problem i lysogenkulturen og vil alltid resultere i uttrykk for lytiske syklusassosierte gener. Profilering viser imidlertid at genene assosiert med den lytiske replikasjonssyklusen er undertrykt i deres ekspre-induksjon (minst to logfolder) og oppregulert postinduksjon.
De tidligere utførte transkriptomiske analysene av Stx-faginteraksjoner med E. coli støtter en grundig forståelse av faggenene som er involvert i å opprettholde lysogeni og utløse den lytiske syklusen11,17. For tiden har LES-fagene til P. aeruginosa blitt annotert, men deres nøkkelgenfunksjoner er mindre godt forstått. Transkriptomiske studier vil muliggjøre re-annotasjon av LES-profagene og forbedre vår forståelse av genene som er involvert i lysogeni og lytisk syklus. Kobling av gensekvens til funksjon representerer en stor utfordring i studiet av nye profager, noe som ytterligere fremhever behovet for flere studier for å bekrefte faggenfunksjonene for produksjon av bedre merknadsverktøy47. Den bredere anvendelsen og tilpasningen av protokollene og ekstra kvalitetskontrolltiltak som er beskrevet i denne videoartikkelen, kan bidra til å avdekke ulike profagfunksjoner og dermed forbedre merknadsrørledninger og transformere vår forståelse av- og bakteriebiologi.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |