TACI: 3D 칼슘 이미징 분석을 위한 ImageJ 플러그인
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging(TACI)은 z축의 움직임을 검사하고 각 z-스택의 최대값을 식별하여 해당 시점에서 세포의 강도를 나타내는 3D 칼슘 이미징 분석을 위한 오픈 소스 ImageJ 플러그인입니다. 측면(x/y) 방향으로 겹치지만 다른 z-평면에서 겹치는 뉴런을 분리할 수 있습니다.
Abstract
신경과학 연구는 복잡한 이미징 및 계산 도구를 사용하여 데이터 세트에서 포괄적인 정보를 추출하도록 발전했습니다. 칼슘 이미징은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 정교한 소프트웨어가 필요한 널리 사용되는 기술이지만 많은 실험실에서 최신 표준을 충족하도록 프로토콜을 업데이트할 때 계산 방법을 채택하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 프로그래밍 지식과 소프트웨어에 대한 페이월의 부족으로 인해 어려움이 발생합니다. 또한 관심 세포는 칼슘 이미징 중에 모든 방향으로 움직임을 나타냅니다. 측면(x/y) 방향의 모션을 수정하기 위해 많은 접근 방식이 개발되었습니다.
이 백서에서는 새로운 ImageJ 플러그인인 TACI(TrackMate Analysis of Calcium Imaging)를 사용하여 3D 칼슘 이미징에서 z축의 모션을 검사하는 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 소프트웨어는 뉴런이 나타나는 모든 z-위치에서 최대 형광 값을 식별하고 이를 사용하여 해당 t-위치에서 뉴런의 강도를 나타냅니다. 따라서 이 도구는 측면(x/y) 방향으로 겹치지만 별개의 z-평면에 나타나는 뉴런을 분리할 수 있습니다. ImageJ 플러그인인 TACI는 3D 칼슘 이미징 분석을 위한 사용자 친화적인 오픈 소스 계산 도구입니다. 우리는 온도 변동 동안 모든 방향으로의 움직임을 표시하는 파리 유충 온도에 민감한 뉴런과 파리 뇌에서 얻은 3D 칼슘 이미징 데이터 세트를 사용하여 이 워크플로를 검증했습니다.
Introduction
세포 내 칼슘 수치는 신경 흥분성의 정확한 지표입니다. 칼슘 이미징은 세포 내 칼슘의 변화를 측정하여 신경 활동을 이해합니다1. 신경과학 연구에서는 유전적 접근을 통해 특정 뉴런 세트에서 비침습적으로 발현될 수 있는 GCaMP 2,3과 같은 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 포함하여 세포 내 칼슘 농도를 측정하는 기술의 개발로 인해 이 방법을 점점 더 많이 사용하고 있습니다. 레이저와 현미경 부품의 비용 절감은 칼슘 이미징의 사용도 증가시켰다4. 중요한 것은 칼슘 이미징을 통해 자유롭게 움직이는 동물에서 단일 뉴런과 큰 뉴런 집단을 동시에 기록하고 연구할 수 있다는것입니다 5.
그럼에도 불구하고, 칼슘 이미징 데이터의 분석은 (1) 시간 경과에 따른 개별 세포의 형광 변화를 추적하는 것을 포함하고, (2) 형광 신호가 간헐적으로 사라지거나 뉴런 반응과 함께 다시 나타나고, (3) 뉴런이 모든 방향, 특히 초점면 안팎으로 이동하거나 여러 평면에 나타날 수 있기 때문에 어렵습니다4. 6입니다. 수동 분석은 시간이 많이 걸리고 기록 길이와 뉴런 수가 증가함에 따라 실용적이지 않습니다. 칼슘 이미징 분석 프로세스를 가속화하기 위해 다양한 소프트웨어 프로그램이 개발되었습니다. 이전에는 소프트웨어가 제한된 실험 맥락에서 설계되어 다른 실험실에서 소프트웨어를 채택하기가 어려웠습니다. 소프트웨어 공유에 대한 현대적 표준을 충족시키려는 최근의 노력은 상이한 그룹들에 걸쳐 칼슘 이미징 데이터를 일관되게 분석할 수 있는 몇몇 도구들의 개발로 이어졌다 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . 그러나 이러한 도구의 대부분은 프로그래밍 지식이 필요하거나 상용 소프트웨어에 의존합니다. 프로그래밍 지식과 소프트웨어 페이월의 부족으로 인해 연구원들은 이러한 방법을 채택하지 못합니다. 또한, 이러한 도구들 중 다수는 x/y 모션을 교정하는 데 초점을 맞추지만, z축의 모션도 명시적으로 진단하고 교정해야 한다6. z-드리프트를 나타내고 여러 z-평면에 나타나는 뉴런에 초점을 맞춘 3D 칼슘 이미징을 분석하기 위한 계산 도구가 필요합니다. 이상적으로 이 도구는 오픈 소스 소프트웨어를 사용해야 하며 다른 실험실에서 쉽게 채택할 수 있도록 프로그래밍 지식이 필요하지 않아야 합니다.
여기에서 우리는 3D 칼슘 이미징 데이터를 분석하기 위해 새로운 ImageJ 플러그인인 TACI를 개발했습니다. 먼저, 필요한 경우 소프트웨어의 이름을 바꾸고 3D 칼슘 이미징 데이터를 z 위치별로 구성합니다. 관심 있는 세포는 각 z 위치에서 추적되고 형광 강도는 TrackMate 또는 기타 계산 도구에 의해 추출됩니다. 그런 다음 TACI를 적용하여 z축의 모션을 검사합니다. z-스택의 최대값을 식별하고 이를 사용하여 해당 시점에서 셀의 강도를 나타냅니다. 이 워크플로우는 모든 방향의 움직임 및/또는 측면(x/y) 방향에서 겹치지만 다른 z 위치에 나타나는 뉴런이 있는 3D 칼슘 이미징을 분석하는 데 적합합니다. 이 워크플로우를 검증하기 위해 뇌의 파리 유충 온도에 민감한 뉴런과 버섯 뉴런의 3D 칼슘 이미징 데이터 세트가 사용되었습니다. 참고로 TACI는 오픈 소스 ImageJ 플러그인이며 프로그래밍 지식이 필요하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 새로운 ImageJ 플러그인인 TACI를 개발하고 3D 칼슘 이미징을 분석하는 워크플로를 설명했습니다. 현재 사용 가능한 많은 도구는 x/y 모션을 수정하는 데 중점을 두고 있지만 z축의 모션도 명시적으로 진단하거나 수정해야 합니다6. 살아있는 유기체에서 이미지를 획득하는 동안 유기체가 고정되어 있어도 z축의 움직임은 피할 수 없으며 온도 변화와 같은 일부 자극은 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fralin Imaging Center의 Zeiss LSM 880을 사용하여 칼슘 이미징 데이터를 수집했습니다. IMARIS 소프트웨어에 도움을 주신 Michelle L Olsen 박사님과 Yuhang Pan 박사님께 감사드립니다. 원고에 대한 건설적인 의견을 주신 Lenwood S. Heath 박사님과 GitHub README 파일에 대한 의견을 주신 Steven Giavasis에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH R21MH122987(https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) 및 NIH R01GM140130(https://www.nigms.nih.gov/)에 의해 L.N.에 의해 지원되었습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
Riferimenti
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
