TACI: En ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) er en åpen kildekode ImageJ plugin for 3D kalsium imaging analyse som undersøker bevegelse på z-aksen og identifiserer den maksimale verdien av hver z-stack å representere en celle intensitet på tilsvarende tidspunkt. Det kan skille nevroner som overlapper i lateral (x / y) retning, men på forskjellige z-plan.
Abstract
Forskning innen nevrovitenskap har utviklet seg til å bruke komplekse bildebehandlings- og beregningsverktøy for å trekke ut omfattende informasjon fra datasett. Kalsiumavbildning er en mye brukt teknikk som krever sofistikert programvare for å oppnå pålitelige resultater, men mange laboratorier sliter med å vedta beregningsmetoder når de oppdaterer protokoller for å oppfylle moderne standarder. Vanskeligheter oppstår på grunn av mangel på programmeringskunnskap og betalingsmurer for programvare. I tillegg viser celler av interesse bevegelser i alle retninger under kalsiumavbildning. Mange tilnærminger har blitt utviklet for å korrigere bevegelsen i lateral (x / y) retning.
Dette papiret beskriver en arbeidsflyt ved hjelp av en ny ImageJ-plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), for å undersøke bevegelse på z-aksen i 3D-kalsiumavbildning. Denne programvaren identifiserer den maksimale fluorescensverdien fra alle z-posisjonene et nevron vises i, og bruker det til å representere nevronets intensitet ved den tilsvarende t-posisjonen. Derfor kan dette verktøyet skille nevroner som overlapper i lateral (x / y) retning, men vises på forskjellige z-plan. Som et ImageJ-plugin er TACI et brukervennlig, åpen kildekode-beregningsverktøy for 3D-kalsiumbildeanalyse. Vi validerte denne arbeidsflyten ved hjelp av fluelarver termosensitive nevroner som viste bevegelser i alle retninger under temperatursvingninger og et 3D kalsiumavbildningsdatasett anskaffet fra fluehjernen.
Introduction
Nivået av intracellulært kalsium er en presis markør for neuronal excitability. Kalsiumavbildning måler endringene i intracellulært kalsium for å forstå nevronaktivitet1. Studier i nevrovitenskap har i økende grad brukt denne metoden på grunn av utviklingen av teknikker for måling av intracellulær kalsiumkonsentrasjon, inkludert genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI), som GCaMP2,3, som kan uttrykkes ikke-invasivt i spesifikke sett med nevroner gjennom genetiske tilnærminger. De lavere kostnadene for lasere og mikroskopkomponenter har også økt bruken av kalsiumavbildning4. Det er viktig at kalsiumavbildning gjør det mulig å registrere og studere enkeltnevroner så vel som store nevronpopulasjoner samtidig i fritt bevegelige dyr5.
Likevel er analysen av kalsiumavbildningsdata utfordrende fordi (1) det innebærer å spore endringene i fluorescens av individuelle celler over tid, (2) fluorescenssignalet forsvinner periodisk eller dukker opp igjen med nevronresponser, og (3) nevronene kan bevege seg i alle retninger, spesielt inn og ut av et fokalplan eller vises på flere plan4, 6. Manuell analyse er tidkrevende og blir upraktisk ettersom lengden på opptak og antall nevroner øker. Ulike programmer er utviklet for å akselerere prosessen med å analysere kalsiumavbildning. Tidligere ble programvare utviklet i en begrenset eksperimentell sammenheng, noe som gjorde det vanskelig for andre laboratorier å ta den i bruk. Nylige anstrengelser for å møte moderne standarder for programvaredeling har ført til utvikling av flere verktøy som konsekvent kan analysere kalsiumavbildningsdata på tvers av ulike grupper: 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Imidlertid krever de fleste av disse verktøyene programmeringskunnskap og / eller er avhengige av kommersiell programvare. Mangel på programmeringskunnskap og betalingsmurer for programvare avskrekker forskere fra å ta i bruk disse metodene. Videre fokuserer mange av disse verktøyene på å korrigere x / y-bevegelsen, selv om bevegelse på z-aksen også må diagnostiseres og korrigeres eksplisitt6. Det er behov for et beregningsverktøy for å analysere 3D-kalsiumavbildning som fokuserer på nevroner som viser z-drift og vises på flere z-plan. Ideelt sett bør dette verktøyet bruke åpen kildekode-programvare og ikke kreve programmeringskunnskap for å tillate andre laboratorier å lett vedta det.
Her utviklet vi en ny ImageJ-plugin, TACI, for å analysere 3D-kalsiumavbildningsdata. Først endrer programvaren navn, om nødvendig, og organiserer 3D-kalsiumavbildningsdataene etter z-posisjoner. De interessante cellene spores i hver z-posisjon, og fluorescensintensiteten ekstraheres av TrackMate eller andre beregningsverktøy. TACI brukes deretter for å undersøke bevegelsen på z-aksen. Den identifiserer maksimumsverdien for en z-stakk og bruker den til å representere en celles intensitet på det tilsvarende tidspunktet. Denne arbeidsflyten er egnet til å analysere 3D kalsiumavbildning med bevegelse i alle retninger og/eller med nevroner som overlapper i lateral (x/y) retning, men som opptrer i forskjellige z-posisjoner. For å validere denne arbeidsflyten ble 3D kalsiumavbildningsdatasett fra fluelarver termosensitive nevroner og soppnevroner i hjernen brukt. Merk at TACI er et åpen kildekode ImageJ-plugin og krever ingen programmeringskunnskap.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien utviklet et nytt ImageJ-plugin, TACI, og beskrev en arbeidsflyt som analyserte 3D-kalsiumavbildning. Mange tilgjengelige verktøy fokuserer på å korrigere x / y-bevegelsen, selv om bevegelse på z-aksen også må diagnostiseres eksplisitt eller korrigeres6. Under bildeopptak i en levende organisme er bevegelse på z-aksen uunngåelig selv når organismen er immobilisert, og noen stimuli, som temperaturendring, forårsaker ofte betydelig z-drift. Å øke høyden på z-stakkene vil t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En Zeiss LSM 880 i Fralin Imaging Center ble brukt til å samle inn kalsiumavbildningsdata. Vi anerkjenner Dr. Michelle L Olsen og Yuhang Pan for deres hjelp med IMARIS-programvaren. Vi anerkjenner Dr. Lenwood S. Heath for konstruktive kommentarer til manuskriptet og Steven Giavasis for kommentarer til GitHub README-filen. Dette arbeidet ble støttet av NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) og NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) til L.N. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
Riferimenti
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
