TACI: En ImageJ Plugin för 3D kalcium bildanalys
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) är ett ImageJ-plugin med öppen källkod för 3D-kalciumavbildningsanalys som undersöker rörelse på z-axeln och identifierar det maximala värdet för varje z-stack för att representera en cells intensitet vid motsvarande tidpunkt. Det kan separera neuroner som överlappar i lateral (x / y) riktning men på olika z-plan.
Abstract
Forskning inom neurovetenskap har utvecklats till att använda komplexa bild- och beräkningsverktyg för att extrahera omfattande information från datamängder. Kalciumavbildning är en allmänt använd teknik som kräver sofistikerad programvara för att få tillförlitliga resultat, men många laboratorier kämpar för att anta beräkningsmetoder när de uppdaterar protokoll för att uppfylla moderna standarder. Svårigheter uppstår på grund av brist på programmeringskunskap och betalväggar för programvara. Dessutom visar celler av intresse rörelser i alla riktningar under kalciumavbildning. Många metoder har utvecklats för att korrigera rörelsen i lateral (x/y) riktning.
Detta dokument beskriver ett arbetsflöde som använder ett nytt ImageJ-plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), för att undersöka rörelse på z-axeln i 3D-kalciumavbildning. Denna programvara identifierar det maximala fluorescensvärdet från alla z-positioner som en neuron visas i och använder den för att representera neuronens intensitet vid motsvarande t-position. Därför kan detta verktyg separera neuroner som överlappar i lateral (x / y) riktning men visas på distinkta z-plan. Som ett ImageJ-plugin är TACI ett användarvänligt beräkningsverktyg med öppen källkod för 3D-kalciumavbildningsanalys. Vi validerade detta arbetsflöde med hjälp av fluglarvens värmekänsliga neuroner som visade rörelser i alla riktningar under temperaturfluktuationer och en 3D-kalciumbilddataset förvärvad från flughjärnan.
Introduction
Nivån av intracellulärt kalcium är en exakt markör för neuronal excitabilitet. Kalciumavbildning mäter förändringarna i intracellulärt kalcium för att förstå neuronal aktivitet1. Studier inom neurovetenskap har alltmer använt denna metod på grund av utvecklingen av tekniker för mätning av intracellulär kalciumkoncentration, inklusive genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI), såsom GCaMP2,3, som kan uttryckas icke-invasivt i specifika uppsättningar neuroner genom genetiska metoder. De lägre kostnaderna för lasrar och mikroskopkomponenter har också ökat användningen av kalciumavbildning4. Viktigt är att kalciumavbildning möjliggör inspelning och studier av enskilda neuroner såväl som stora neuronpopulationer samtidigt i fritt rörliga djur5.
Ändå är analysen av kalciumavbildningsdata utmanande eftersom (1) det handlar om att spåra förändringarna i fluorescens hos enskilda celler över tiden, (2) fluorescenssignalen försvinner intermittent eller återkommer med neuronala svar, och (3) neuronerna kan röra sig i alla riktningar, särskilt in och ut ur ett fokalplan eller visas på flera plan4, 6. Manuell analys är tidskrävande och blir opraktisk när längden på inspelningar och antalet neuroner ökar. Olika program har utvecklats för att påskynda processen att analysera kalciumavbildning. Tidigare utformades programvara i ett begränsat experimentellt sammanhang, vilket gjorde det svårt för andra laboratorier att anta det. Nya ansträngningar för att uppfylla moderna standarder för programvarudelning har lett till utvecklingen av flera verktyg som konsekvent kan analysera kalciumavbildningsdata över olika grupper 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . De flesta av dessa verktyg kräver dock programmeringskunskap och / eller är beroende av kommersiell programvara. Brist på programmeringskunskap och mjukvaruväggar avskräcker forskare från att anta dessa metoder. Dessutom fokuserar många av dessa verktyg på att korrigera x/y-rörelsen, även om rörelse på z-axeln också måste diagnostiseras och korrigerasexplicit 6. Det finns ett behov av ett beräkningsverktyg för att analysera 3D-kalciumavbildning som fokuserar på neuroner som uppvisar z-drift och uppträder på flera z-plan. Helst bör detta verktyg använda programvara med öppen källkod och inte kräva programmeringskunskap för att andra laboratorier lätt ska kunna anta det.
Här utvecklade vi ett nytt ImageJ-plugin, TACI, för att analysera 3D-kalciumbilddata. Först byter programvaran namn, om det behövs, och organiserar 3D-kalciumbildningsdata efter z-positioner. Cellerna av intresse spåras i varje z-position, och deras fluorescensintensiteter extraheras av TrackMate eller andra beräkningsverktyg. TACI används sedan för att undersöka rörelsen på z-axeln. Den identifierar det maximala värdet för en z-stack och använder den för att representera en cells intensitet vid motsvarande tidpunkt. Detta arbetsflöde är lämpligt för att analysera 3D-kalciumavbildning med rörelse i alla riktningar och / eller med neuroner som överlappar i lateral (x / y) riktning men visas i olika z-positioner. För att validera detta arbetsflöde användes 3D-kalciumavbildningsdataset från fluglarvers värmekänsliga neuroner och svampneuroner i hjärnan. Observera att TACI är ett ImageJ-plugin med öppen källkod och kräver ingen programmeringskunskap.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie utvecklade ett nytt ImageJ-plugin, TACI, och beskrev ett arbetsflöde som analyserade 3D-kalciumavbildning. Många för närvarande tillgängliga verktyg fokuserar på att korrigera x / y-rörelsen, även om rörelse på z-axeln också måste diagnostiseras eller korrigerasexplicit 6. Under bildförvärv i en levande organism är rörelse på z-axeln oundviklig även när organismen är immobiliserad, och vissa stimuli, såsom temperaturförändring, orsakar ofta signifikant z-drift. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En Zeiss LSM 880 i Fralin Imaging Center användes för att samla in kalciumavbildningsdata. Vi tackar Dr. Michelle L Olsen och Yuhang Pan för deras hjälp med IMARIS-programvaran. Vi tackar Dr. Lenwood S. Heath för konstruktiva kommentarer om manuskriptet och Steven Giavasis för kommentarer om GitHub README-filen. Detta arbete stöddes av NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) och NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) till L.N. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
Riferimenti
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
