Effektiv PAM-fri baseredigering til zebrafiskmodellering af menneskelig genetisk sygdom med zSpRY-ABE8e
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører effektiv adeninbaseredigering uden PAM-begrænsning for at konstruere en præcis zebrafisksygdomsmodel ved hjælp af zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR/Cas9-teknologien har øget zebrafiskens værdi til modellering af humane genetiske sygdomme, undersøgelse af sygdomspatogenese og lægemiddelscreening, men begrænsninger i protospacer tilstødende motiv (PAM) er en stor hindring for at skabe nøjagtige dyremodeller af humane genetiske lidelser forårsaget af enkeltnukleotidvarianter (SNV’er). Indtil nu har nogle SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet vist effektivitet i zebrafisk. Anvendelsen af den optimerede SpRY-medierede adenindaspaleditor (ABE), zSpRY-ABE8e og syntetisk modificeret gRNA i zebrafisk har muliggjort effektiv adenin-guanin-basekonvertering uden PAM-begrænsning. Her beskrives en protokol til effektiv adeninbaseredigering uden PAM-begrænsning i zebrafisk ved hjælp af zSpRY-ABE8e. Ved at injicere en blanding af zSpRY-ABE8e mRNA og syntetisk modificeret gRNA i zebrafiskembryoner blev en zebrafisksygdomsmodel konstrueret med en præcis mutation, der simulerede et patogent sted for TSR2-ribosommodningsfaktoren (tsr2). Denne metode giver et værdifuldt værktøj til etablering af nøjagtige sygdomsmodeller til undersøgelse af sygdomsmekanismer og behandlinger.
Introduction
Enkeltnukleotidvarianter (SNV’er), der forårsager missense eller nonsensmutationer, er den mest almindelige kilde til mutationer i det humane genom1. For at afgøre, om en bestemt SNV er patogen, og for at kaste lys over dens patogenese kræves præcise dyremodeller2. Zebrafisk er gode modeller for sygdomme hos mennesker, der udviser en høj grad af fysiologisk og genetisk homologi hos mennesker, en kort udviklingscyklus og en stærk reproduktionsevne, hvilket er fordelagtigt for forskning i patogene egenskaber og mekanismer samt lægemiddelscreening3.
Det grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/Cas9-systemet er blevet anvendt i vid udstrækning i genomredigering af forskellige arter, herunder zebrafisk4. Med gRNA-vejledning kan CRISPR/Cas9-systemet generere DNA-dobbeltstrengede brud (DSB’er) på målstedet, som derefter tillader enkeltbasesubstitution gennem rekombination af målstedet med donor-DNA-skabeloner via den homologi-rettede reparationsvej (HDR). Imidlertid er effektiviteten af denne baseudskiftningsmetode ret lav, da den cellulære DNA-reparationsproces hovedsageligt udføres af den ikke-homologe endesammenføjningsvej (NHEJ), som normalt ledsages af insertions- og deletion (indel) mutationer5. Heldigvis afhjælper CRISPR/Cas9-baseret single-base-redigeringsteknologi dette problem betydeligt ved at bruge baseeditorer, som muliggør mere effektiv single-base-redigering uden at inducere DSB’er. To hovedklasser af baseredaktører, adeninbaseeditorer (ABE’er) og cytosinbaseeditorer (CBE’er), er blevet udviklet til at implementere basesubstitutionsredigering for A· T til G· C og C·G til T· A, henholdsvis 6,7,8,9,10,11. Disse fire typer basesubstitutioner dækker 30 % af de humane patogene varianter12. Begge klasser af basisredaktører, herunder PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 og ABE8e, er blevet rapporteret at fungere i zebrafisk, hvor BE4max og ABE8e især rapporteres at opnå høj redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner fra forskellige arter, herunder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes og S. canis, er blevet implementeret i zebrafiskens genredigering, hvor Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) anvendes mest udbredt 20,21,22,23. SpCas9 kan dog kun genkende målsteder med et NGG-protospacer tilstødende motiv (PAM), hvilket begrænser dets redigerbare rækkevidde og kan resultere i, at der ikke findes nogen passende sekvens nær det patogene sted af interesse24. For at udvide målområdet er en række SpCas9-varianter blevet konstrueret til at genkende forskellige PAM’er gennem styret evolution og strukturstyret design. Imidlertid er få varianter effektive i dyr, især hos zebrafisk, hvilket begrænser anvendelsen af zebrafisk i SNV-relateret sygdomsforskning25,26,27,28. For nylig er to varianter af SpCas9, SpG og SpRY med mindre strenge PAM-begrænsninger (NGN for SpG og NNN for SpRY med en højere præference for NRN end NYN) blevet rapporteret at udvise høj redigeringsaktivitet i humane celler og planter 29,30,31,32. Efterfølgende er SpG og SpRY samt en række af deres medierede baseredaktører, såsom SpRY-medierede CBE’er og SpRY-medierede ABE’er, også rapporteret at arbejde i zebrafisk, hvilket vil forbedre anvendelsen af zebrafiskmodeller i den mekanistiske undersøgelse og lægemiddelscreening af SNV-relaterede sygdomme 18,33,34,35. Desuden blev i-Silence foreslået som en effektiv og præcis gen-knockout-strategi gennem ABE-medieret startkodonkonvertering fra ATG til GTG eller ACG36. Kombinationen af i-Silence-strategien og den SpRY-medierede baseeditor zSpRY-ABE8e giver en ny metode til sygdomsmodellering18. Denne protokol demonstrerer, hvordan man udfører genredigering ved hjælp af zSpRY-ABE8e i zebrafisk for at konstruere en tsr2 (M1V) model ved hjælp af i-Silence-strategien. Redigeringseffektiviteten og fænotyperne, der optræder i zebrafiskmodeller, blev vurderet og analyseret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver konstruktionen af en zebrafisksygdomsmodel ved hjælp af basiseditoren zSpRY-ABE8e. Sammenlignet med den traditionelle HDR-vej til basesubstitution kan denne protokol opnå mere effektiv baseredigering og reducere forekomsten af indels. Samtidig indebærer denne protokol implementering af den nyligt foreslåede i-Silence gen-knockout-strategi i zebrafisk. Samlet set vil zSpRY-ABE8e forbedre anvendelsen af zebrafiskmodeller i sygdomsforskning.
Off-target effekter er et …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Barbara Garbers, ph.d., fra Liwen Bianji (Edanz) for at redigere den engelske tekst til et udkast til dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af nøgleområdets forsknings- og udviklingsprogram i Guangdong-provinsen (2019B030335001), Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) og forskningsfondsprogrammet for Guangdong Provincial Key Lab of Pathogen Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
Riferimenti
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
