Denne protokol beskriver, hvordan man udfører effektiv adeninbaseredigering uden PAM-begrænsning for at konstruere en præcis zebrafisksygdomsmodel ved hjælp af zSpRY-ABE8e.
CRISPR/Cas9-teknologien har øget zebrafiskens værdi til modellering af humane genetiske sygdomme, undersøgelse af sygdomspatogenese og lægemiddelscreening, men begrænsninger i protospacer tilstødende motiv (PAM) er en stor hindring for at skabe nøjagtige dyremodeller af humane genetiske lidelser forårsaget af enkeltnukleotidvarianter (SNV’er). Indtil nu har nogle SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet vist effektivitet i zebrafisk. Anvendelsen af den optimerede SpRY-medierede adenindaspaleditor (ABE), zSpRY-ABE8e og syntetisk modificeret gRNA i zebrafisk har muliggjort effektiv adenin-guanin-basekonvertering uden PAM-begrænsning. Her beskrives en protokol til effektiv adeninbaseredigering uden PAM-begrænsning i zebrafisk ved hjælp af zSpRY-ABE8e. Ved at injicere en blanding af zSpRY-ABE8e mRNA og syntetisk modificeret gRNA i zebrafiskembryoner blev en zebrafisksygdomsmodel konstrueret med en præcis mutation, der simulerede et patogent sted for TSR2-ribosommodningsfaktoren (tsr2). Denne metode giver et værdifuldt værktøj til etablering af nøjagtige sygdomsmodeller til undersøgelse af sygdomsmekanismer og behandlinger.
Enkeltnukleotidvarianter (SNV’er), der forårsager missense eller nonsensmutationer, er den mest almindelige kilde til mutationer i det humane genom1. For at afgøre, om en bestemt SNV er patogen, og for at kaste lys over dens patogenese kræves præcise dyremodeller2. Zebrafisk er gode modeller for sygdomme hos mennesker, der udviser en høj grad af fysiologisk og genetisk homologi hos mennesker, en kort udviklingscyklus og en stærk reproduktionsevne, hvilket er fordelagtigt for forskning i patogene egenskaber og mekanismer samt lægemiddelscreening3.
Det grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/Cas9-systemet er blevet anvendt i vid udstrækning i genomredigering af forskellige arter, herunder zebrafisk4. Med gRNA-vejledning kan CRISPR/Cas9-systemet generere DNA-dobbeltstrengede brud (DSB’er) på målstedet, som derefter tillader enkeltbasesubstitution gennem rekombination af målstedet med donor-DNA-skabeloner via den homologi-rettede reparationsvej (HDR). Imidlertid er effektiviteten af denne baseudskiftningsmetode ret lav, da den cellulære DNA-reparationsproces hovedsageligt udføres af den ikke-homologe endesammenføjningsvej (NHEJ), som normalt ledsages af insertions- og deletion (indel) mutationer5. Heldigvis afhjælper CRISPR/Cas9-baseret single-base-redigeringsteknologi dette problem betydeligt ved at bruge baseeditorer, som muliggør mere effektiv single-base-redigering uden at inducere DSB’er. To hovedklasser af baseredaktører, adeninbaseeditorer (ABE’er) og cytosinbaseeditorer (CBE’er), er blevet udviklet til at implementere basesubstitutionsredigering for A· T til G· C og C·G til T· A, henholdsvis 6,7,8,9,10,11. Disse fire typer basesubstitutioner dækker 30 % af de humane patogene varianter12. Begge klasser af basisredaktører, herunder PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 og ABE8e, er blevet rapporteret at fungere i zebrafisk, hvor BE4max og ABE8e især rapporteres at opnå høj redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner fra forskellige arter, herunder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes og S. canis, er blevet implementeret i zebrafiskens genredigering, hvor Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) anvendes mest udbredt 20,21,22,23. SpCas9 kan dog kun genkende målsteder med et NGG-protospacer tilstødende motiv (PAM), hvilket begrænser dets redigerbare rækkevidde og kan resultere i, at der ikke findes nogen passende sekvens nær det patogene sted af interesse24. For at udvide målområdet er en række SpCas9-varianter blevet konstrueret til at genkende forskellige PAM’er gennem styret evolution og strukturstyret design. Imidlertid er få varianter effektive i dyr, især hos zebrafisk, hvilket begrænser anvendelsen af zebrafisk i SNV-relateret sygdomsforskning25,26,27,28. For nylig er to varianter af SpCas9, SpG og SpRY med mindre strenge PAM-begrænsninger (NGN for SpG og NNN for SpRY med en højere præference for NRN end NYN) blevet rapporteret at udvise høj redigeringsaktivitet i humane celler og planter 29,30,31,32. Efterfølgende er SpG og SpRY samt en række af deres medierede baseredaktører, såsom SpRY-medierede CBE’er og SpRY-medierede ABE’er, også rapporteret at arbejde i zebrafisk, hvilket vil forbedre anvendelsen af zebrafiskmodeller i den mekanistiske undersøgelse og lægemiddelscreening af SNV-relaterede sygdomme 18,33,34,35. Desuden blev i-Silence foreslået som en effektiv og præcis gen-knockout-strategi gennem ABE-medieret startkodonkonvertering fra ATG til GTG eller ACG36. Kombinationen af i-Silence-strategien og den SpRY-medierede baseeditor zSpRY-ABE8e giver en ny metode til sygdomsmodellering18. Denne protokol demonstrerer, hvordan man udfører genredigering ved hjælp af zSpRY-ABE8e i zebrafisk for at konstruere en tsr2 (M1V) model ved hjælp af i-Silence-strategien. Redigeringseffektiviteten og fænotyperne, der optræder i zebrafiskmodeller, blev vurderet og analyseret.
Denne protokol beskriver konstruktionen af en zebrafisksygdomsmodel ved hjælp af basiseditoren zSpRY-ABE8e. Sammenlignet med den traditionelle HDR-vej til basesubstitution kan denne protokol opnå mere effektiv baseredigering og reducere forekomsten af indels. Samtidig indebærer denne protokol implementering af den nyligt foreslåede i-Silence gen-knockout-strategi i zebrafisk. Samlet set vil zSpRY-ABE8e forbedre anvendelsen af zebrafiskmodeller i sygdomsforskning.
Off-target effekter er et …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Barbara Garbers, ph.d., fra Liwen Bianji (Edanz) for at redigere den engelske tekst til et udkast til dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af nøgleområdets forsknings- og udviklingsprogram i Guangdong-provinsen (2019B030335001), Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) og forskningsfondsprogrammet for Guangdong Provincial Key Lab of Pathogen Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
mMACHINE kit | |||
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |