Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e
Summary
Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR / Cas9-technologie heeft de waarde van zebravissen verhoogd voor het modelleren van menselijke genetische ziekten, het bestuderen van ziektepathogenese en medicijnscreening, maar protospacer adjacent motif (PAM) -beperkingen zijn een belangrijk obstakel voor het creëren van nauwkeurige diermodellen van menselijke genetische aandoeningen veroorzaakt door single-nucleotidevarianten (SNV’s). Tot nu toe hebben sommige SpCas9-varianten met brede PAM-compatibiliteit efficiëntie getoond in zebravissen. De toepassing van de geoptimaliseerde SpRY-gemedieerde adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravissen heeft een efficiënte adenine-guanine base conversie mogelijk gemaakt zonder PAM-beperking. Hier wordt een protocol beschreven voor efficiënte adeninebasisbewerking zonder PAM-beperking in zebravissen met behulp van zSpRY-ABE8e. Door een mengsel van zSpRY-ABE8e mRNA en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravisembryo’s te injecteren, werd een zebravisziektemodel geconstrueerd met een precieze mutatie die een pathogene plaats van de TSR2-ribosoomrijpingsfactor (tsr2) simuleerde. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het opzetten van nauwkeurige ziektemodellen voor het bestuderen van ziektemechanismen en behandelingen.
Introduction
Single-nucleotide varianten (SNV’s) die missense of nonsense mutaties veroorzaken zijn de meest voorkomende bron van mutaties in het menselijk genoom1. Om te bepalen of een bepaalde SNV pathogeen is en om licht te werpen op de pathogenese ervan, zijn nauwkeurige diermodellen nodig2. Zebravissen zijn goede menselijke ziektemodellen, vertonen een hoge mate van fysiologische en genetische homologie met mensen, een korte ontwikkelingscyclus en een sterk voortplantingsvermogen, wat gunstig is voor onderzoek naar pathogene kenmerken en mechanismen, evenals geneesmiddelenscreening3.
Het clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-systeem is op grote schaal toegepast in de genoombewerking van verschillende soorten, waaronder zebravis4. Met gRNA-begeleiding kan het CRISPR/Cas9-systeem DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB’s) genereren op de doellocatie, die vervolgens single-base substitutie mogelijk maakt door recombinatie van de doellocatie met donor-DNA-sjablonen via de homologie-gerichte reparatie (HDR) -route. De efficiëntie van deze basevervangingsmethode is echter vrij laag omdat het cellulaire DNA-reparatieproces voornamelijk wordt uitgevoerd door de niet-homologe end-joining (NHEJ) -route, die meestal gepaard gaat met insertie- en deletiemutaties (indel)5. Gelukkig verlicht CRISPR / Cas9-gebaseerde single-base bewerkingstechnologie dit probleem aanzienlijk door basiseditors te gebruiken, die efficiëntere single-base editing mogelijk maken zonder DSB’s te induceren. Twee belangrijke klassen van base editors, adenine base editors (ABE’s) en cytosine base editors (CBE’s), zijn ontwikkeld om base substitution editing voor A· T tot G· C en C·G t/m T· A, respectievelijk 6,7,8,9,10,11. Deze vier soorten basesubstituties dekken 30% van de humane pathogene varianten12. Van beide klassen van basiseditors, waaronder PmCDA1, BE-systeem, CBE4max, ABE7.10 en ABE8e, is gemeld dat ze werken in zebravissen, waarbij BE4max en ABE8e vooral zijn gemeld om een hoge bewerkingsactiviteit te bereiken 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-eiwitten van verschillende soorten, waaronder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes en S. canis, zijn geïmplementeerd in zebravisgenbewerking, waarbij de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) het meest wordt gebruikt20,21,22,23. SpCas9 kan echter alleen doellocaties herkennen met een NGG protospacer adjacent motif (PAM), wat het bewerkbare bereik beperkt en ertoe kan leiden dat er geen geschikte sequentie wordt gevonden in de buurt van de pathogene site van belang24. Om het doelbereik uit te breiden, zijn verschillende SpCas9-varianten ontworpen om verschillende PAM’s te herkennen door middel van gerichte evolutie en structuurgestuurd ontwerp. Weinig varianten zijn echter effectief bij dieren, vooral bij zebravissen, wat de toepassing van zebravissen in SNV-gerelateerd ziekteonderzoek beperkt25,26,27,28. Onlangs zijn twee varianten van SpCas9, SpG en SpRY, met minder strenge PAM-beperkingen (NGN voor SpG en NNN voor SpRY met een hogere voorkeur voor NRN dan NYN) gemeld om een hoge bewerkingsactiviteit te vertonen in menselijke cellen en planten 29,30,31,32. Vervolgens is gemeld dat SpG en SpRY, evenals een aantal van hun gemedieerde basisredacteuren, zoals SpRY-gemedieerde CBE’s en SpRY-gemedieerde ABE’s, ook werken in zebravissen, wat de toepassing van zebravismodellen in de mechanistische studie en medicijnscreening van SNV-gerelateerde ziekten zal verbeteren 18,33,34,35. Bovendien werd i-Silence voorgesteld als een effectieve en nauwkeurige gen-knock-out strategie door ABE-gemedieerde start codon conversie van ATG naar GTG of ACG36. De combinatie van de i-Silence-strategie en de SpRY-gemedieerde basiseditor zSpRY-ABE8e biedt een nieuwe methode voor ziektemodellering18. Dit protocol laat zien hoe genbewerking met zSpRY-ABE8e in zebravissen kan worden uitgevoerd om een tsr2 (M1V) model te construeren met behulp van de i-Silence-strategie. De bewerkingsefficiëntie en fenotypen die voorkomen in zebravismodellen werden beoordeeld en geanalyseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de constructie van een zebravisziektemodel met behulp van de basiseditor zSpRY-ABE8e. In vergelijking met de traditionele HDR-route voor basisvervanging, kan dit protocol efficiëntere basisbewerking bereiken en het optreden van indelaten verminderen. Tegelijkertijd omvat dit protocol de implementatie van de onlangs voorgestelde i-Silence gen-knock-out strategie in zebravissen. Alles bij elkaar zal zSpRY-ABE8e de toepassing van zebravismodellen in ziekteonderzoek verbeteren.
<p class="jove_con…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Barbara Garbers, PhD, van Liwen Bianji (Edanz) voor het bewerken van de Engelse tekst van een concept van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Key-Area Research and Development Program van de provincie Guangdong (2019B030335001), het National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), de National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) en het Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
Riferimenti
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
