Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.
Abstract
Die CRISPR/Cas9-Technologie hat den Wert des Zebrafisches für die Modellierung menschlicher genetischer Krankheiten, die Untersuchung der Krankheitspathogenese und das Screening von Medikamenten erhöht, aber die Einschränkungen des Protospacer-benachbarten Motivs (PAM) sind ein großes Hindernis für die Erstellung genauer Tiermodelle menschlicher genetischer Erkrankungen, die durch Einzelnukleotidvarianten (SNVs) verursacht werden. Bisher haben einige SpCas9-Varianten mit breiter PAM-Kompatibilität ihre Wirksamkeit im Zebrafisch gezeigt. Die Anwendung des optimierten SpRY-vermittelten Adenin-Basen-Editors (ABE), zSpRY-ABE8e und synthetisch modifizierter gRNA im Zebrafisch hat eine effiziente Adenin-Guanin-Basenumwandlung ohne PAM-Einschränkung ermöglicht. Hier wird ein Protokoll zur effizienten Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Begrenzung im Zebrafisch unter Verwendung von zSpRY-ABE8e beschrieben. Durch die Injektion einer Mischung aus zSpRY-ABE8e mRNA und synthetisch modifizierter gRNA in Zebrafischembryonen wurde ein Zebrafisch-Krankheitsmodell mit einer präzisen Mutation konstruiert, das eine pathogene Stelle des TSR2-Ribosomenreifungsfaktors (tsr2) simulierte. Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für die Etablierung genauer Krankheitsmodelle zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und -behandlungen dar.
Introduction
Einzelnukleotidvarianten (SNVs), die Missense- oder Nonsense-Mutationen verursachen, sind die häufigste Quelle für Mutationen im menschlichen Genom1. Um festzustellen, ob eine bestimmte SNV pathogen ist, und um ihre Pathogenese aufzuklären, sind präzise Tiermodelle erforderlich2. Zebrafische sind gute menschliche Krankheitsmodelle, die ein hohes Maß an physiologischer und genetischer Homologie mit dem Menschen, einen kurzen Entwicklungszyklus und eine starke Fortpflanzungsfähigkeit aufweisen, was für die Erforschung pathogener Eigenschaften und Mechanismen sowie für das Screening von Medikamenten von Vorteil ist3.
Das CRISPR/Cas9-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde in großem Umfang in der Genom-Editierung verschiedener Arten, einschließlich Zebrafisch4, eingesetzt. Mit gRNA-Führung kann das CRISPR/Cas9-System DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) an der Zielstelle erzeugen, die dann eine Einzelbasensubstitution durch Rekombination der Zielstelle mit Spender-DNA-Vorlagen über den Homologie-gerichteten Reparaturweg (HDR) ermöglichen. Die Effizienz dieser Basenersatzmethode ist jedoch recht gering, da der zelluläre DNA-Reparaturprozess hauptsächlich über den nicht-homologen End-Joining-Signalweg (NHEJ) durchgeführt wird, der in der Regel von Insertions- und Deletionsmutationen (Indel-Mutationen) begleitet wird5. Glücklicherweise entschärft die CRISPR/Cas9-basierte Single-Base-Editing-Technologie dieses Problem erheblich, indem sie Basis-Editoren verwendet, die eine effizientere Single-Base-Bearbeitung ermöglichen, ohne DSBs zu induzieren. Zwei Hauptklassen von Baseneditoren, Adenin-Basen-Editoren (ABEs) und Cytosin-Basen-Editoren (CBEs), wurden entwickelt, um die Basensubstitutions-Editierung für A· T bis G· C und C·G bis T· A bzw. 6,7,8,9,10,11. Diese vier Arten von Basensubstitutionen decken 30 % der humanpathogenen Variantenab 12. Es wurde berichtet, dass beide Klassen von Basiseditoren, einschließlich PmCDA1, BE-System, CBE4max, ABE7.10 und ABE8e, in Zebrafischen funktionieren, wobei BE4max und ABE8e insbesondere eine hohe Bearbeitungsaktivität erreichen 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-Proteine aus verschiedenen Spezies, darunter Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und S. canis, wurden in die Genom-Editierung von Zebrafischen implementiert, wobei das Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) am häufigsten verwendet wurde20,21,22,23. SpCas9 kann jedoch nur Zielstellen mit einem NGG-Protospacer-Nachbarmotiv (PAM) erkennen, was seinen editierbaren Bereich einschränkt und dazu führen kann, dass keine geeignete Sequenz in der Nähe des pathogenen Ortes gefunden wird24. Um den Zielbereich zu erweitern, wurde eine Vielzahl von SpCas9-Varianten entwickelt, um verschiedene PAMs durch gerichtete Evolution und strukturgeführtes Design zu erkennen. Allerdings sind nur wenige Varianten bei Tieren wirksam, insbesondere bei Zebrafischen, was die Anwendung von Zebrafischen in der SNV-bezogenen Krankheitsforschung einschränkt25,26,27,28. Kürzlich wurde berichtet, dass zwei Varianten von SpCas9, SpG und SpRY, mit weniger strengen PAM-Einschränkungen (NGN für SpG und NNN für SpRY mit einer höheren Präferenz für NRN als NYN), eine hohe Editieraktivität in menschlichen Zellen und Pflanzen aufweisen 29,30,31,32. In der Folge wurde berichtet, dass SpG und SpRY sowie eine Reihe ihrer vermittelten Basiseditoren, wie z. B. SpRY-vermittelte CBEs und SpRY-vermittelte ABEs, auch im Zebrafisch funktionieren, was die Anwendung von Zebrafischmodellen in der mechanistischen Untersuchung und dem Arzneimittelscreening von SNV-bedingten Krankheiten verbessern wird 18,33,34,35. Darüber hinaus wurde i-Silence als effektive und genaue Gen-Knockout-Strategie durch ABE-vermittelte Start-Codon-Konversion von ATG zu GTG oder ACG36 vorgeschlagen. Die Kombination aus der i-Silence-Strategie und dem SpRY-vermittelten Basiseditor zSpRY-ABE8e stellt eine neue Methode zur Krankheitsmodellierungdar 18. Dieses Protokoll demonstriert, wie Genom-Editierung mit zSpRY-ABE8e im Zebrafisch durchgeführt werden kann, um ein tsr2 (M1V)-Modell unter Verwendung der i-Silence-Strategie zu konstruieren. Die Editiereffizienz und die Phänotypen, die in Zebrafischmodellen auftreten, wurden bewertet und analysiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Zebrafisch-Krankheitsmodells mit Hilfe des Basiseditors zSpRY-ABE8e. Im Vergleich zum herkömmlichen HDR-Pfad für die Basensubstitution kann dieses Protokoll eine effizientere Basisbearbeitung erreichen und das Auftreten von Indels reduzieren. Gleichzeitig beinhaltet dieses Protokoll die Umsetzung der kürzlich vorgeschlagenen i-Silence-Gen-Knockout-Strategie im Zebrafisch. Zusammenfassend wird zSpRY-ABE8e die Anwendung von Zebrafischmodellen in der Krankheitsforschung …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Barbara Garbers, PhD, von Liwen Bianji (Edanz) für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das Key-Area Research and Development Program der Provinz Guangdong (2019B030335001), das National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), die National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) und das Research Fund Program des Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05) unterstützt.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
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