Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e
Summary
Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.
Abstract
La tecnologia CRISPR / Cas9 ha aumentato il valore del pesce zebra per modellare le malattie genetiche umane, studiare la patogenesi delle malattie e lo screening dei farmaci, ma le limitazioni del motivo adiacente protospaziatore (PAM) sono un ostacolo importante alla creazione di modelli animali accurati di malattie genetiche umane causate da varianti a singolo nucleotide (SNV). Fino ad ora, alcune varianti di SpCas9 con ampia compatibilità PAM hanno mostrato efficienza nel pesce zebra. L’applicazione dell’editor di base adenina (ABE) ottimizzato mediato da SpRY, zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificato nel pesce zebra ha consentito un’efficiente conversione della base adenina-guanina senza restrizioni PAM. Qui è descritto un protocollo per l’editing efficiente della base adenina senza limitazioni PAM nel pesce zebra usando zSpRY-ABE8e. Iniettando una miscela di mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificato in embrioni di zebrafish, è stato costruito un modello di malattia zebrafish con una mutazione precisa che simulava un sito patogeno del fattore di maturazione del ribosoma TSR2 (tsr2). Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per la creazione di modelli di malattia accurati per lo studio dei meccanismi e dei trattamenti della malattia.
Introduction
Le varianti a singolo nucleotide (SNV) che causano mutazioni missenso o nonsenso sono la fonte più comune di mutazioni nel genoma umano1. Per determinare se un particolare SNV è patogeno e per far luce sulla sua patogenesi, sono necessari modelli animali precisi2. I pesci zebra sono buoni modelli di malattia umana, che presentano un alto grado di omologia fisiologica e genetica con gli esseri umani, un breve ciclo di sviluppo e una forte capacità riproduttiva, che è vantaggiosa per la ricerca sulle caratteristiche e sui meccanismi patogeni, nonché per lo screening dei farmaci3.
Il sistema CRISPR (Clustered regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 è stato ampiamente applicato nell’editing del genoma di varie specie, tra cui il pesce zebra4. Con la guida del gRNA, il sistema CRISPR / Cas9 può generare rotture a doppio filamento del DNA (DSB) nel sito bersaglio, che consente quindi la sostituzione a base singola attraverso la ricombinazione del sito bersaglio con modelli di DNA del donatore tramite il percorso di riparazione diretta dall’omologia (HDR). Tuttavia, l’efficienza di questo metodo di sostituzione della base è piuttosto bassa in quanto il processo di riparazione del DNA cellulare viene effettuato principalmente dalla via di giunzione finale non omologa (NHEJ), che di solito è accompagnata da mutazioni di inserzione e delezione (indel)5. Fortunatamente, la tecnologia di editing a base singola basata su CRISPR / Cas9 allevia significativamente questo problema utilizzando editor di base, che consentono un editing a base singola più efficiente senza indurre DSB. Due classi principali di editor di base, gli editor di base adenina (ABE) e gli editor di base di citosina (CBE), sono stati sviluppati per implementare l’editing di sostituzione di base per A· Da T a G· C e C·G a T· A, rispettivamente 6,7,8,9,10,11. Questi quattro tipi di sostituzioni di base coprono il 30% delle varianti patogene umane12. Entrambe le classi di editor di base, tra cui PmCDA1, sistema BE, CBE4max, ABE7.10 e ABE8e, sono state segnalate per funzionare nel pesce zebra, con BE4max e ABE8e in particolare segnalati per raggiungere un’elevata attività di editing 13,14,15,16,17,18,19.
Le proteine Cas9 di diverse specie, tra cui Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e S. canis, sono state implementate nell’editing genetico del pesce zebra, con lo Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) utilizzato più ampiamente20,21,22,23. Tuttavia, SpCas9 può riconoscere solo siti bersaglio con un motivo adiacente protospacer NGG (PAM), che limita il suo intervallo modificabile e può comportare che non venga trovata alcuna sequenza adatta vicino al sito patogeno di interesse24. Per ampliare la gamma target, una varietà di varianti di SpCas9 sono state progettate per riconoscere diversi PAM attraverso l’evoluzione diretta e la progettazione guidata dalla struttura. Tuttavia, poche varianti sono efficaci negli animali, specialmente nel pesce zebra, il che limita l’applicazione del pesce zebra nella ricerca sulle malattie correlate al SNV25,26,27,28. Recentemente, due varianti di SpCas9, SpG e SpRY, con restrizioni PAM meno rigorose (NGN per SpG e NNN per SpRY con una preferenza più elevata per NRN rispetto a NYN) sono state segnalate per mostrare un’elevata attività di editing in cellule e piante umane 29,30,31,32. Successivamente, SpG e SpRY, così come un certo numero dei loro editor di base mediati, come CBE mediati da SpRY e ABE mediati da SpRY, sono stati segnalati per lavorare nel pesce zebra, che migliorerà l’applicazione di modelli di zebrafish nello studio meccanicistico e nello screening farmacologico delle malattie correlate a SNV 18,33,34,35. Inoltre, i-Silence è stato proposto come una strategia di knockout genico efficace e accurata attraverso la conversione del codone iniziale mediata da ABE da ATG a GTG o ACG36. La combinazione della strategia i-Silence e dell’editor di base mediato da SpRY zSpRY-ABE8e fornisce un nuovo metodo per la modellazione della malattia18. Questo protocollo dimostra come eseguire l’editing genetico utilizzando zSpRY-ABE8e nel pesce zebra per costruire un modello tsr2 (M1V) utilizzando la strategia i-Silence. L’efficienza di editing e i fenotipi che appaiono nei modelli di zebrafish sono stati valutati e analizzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive la costruzione di un modello di malattia del pesce zebra utilizzando l’editor di base zSpRY-ABE8e. Rispetto al tradizionale percorso HDR per la sostituzione delle basi, questo protocollo può ottenere un editing di base più efficiente e ridurre il verificarsi di indel. Allo stesso tempo, questo protocollo prevede l’implementazione della strategia di knockout del gene i-Silence recentemente proposta nel pesce zebra. Nel suo insieme, zSpRY-ABE8e migliorerà l’applicazione di modelli di zebrafish…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Barbara Garbers, PhD, di Liwen Bianji (Edanz) per aver curato il testo inglese di una bozza di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Programma di ricerca e sviluppo dell’area chiave della provincia del Guangdong (2019B030335001), dal Programma nazionale chiave di ricerca e sviluppo della Cina (2019YFE0106700), dalla National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) e dal Programma del fondo di ricerca del Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
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