zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집
Summary
이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.
Abstract
CRISPR/Cas9 기술은 인간 유전 질환 모델링, 질병 발병기전 연구 및 약물 스크리닝을 위한 제브라피쉬의 가치를 높였지만, 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)로 인한 인간 유전 질환의 정확한 동물 모델을 만드는 데 있어 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 한계가 주요 장애물입니다. 지금까지 광범위한 PAM 호환성을 가진 일부 SpCas9 변종은 제브라피쉬에서 효율성을 보여주었습니다. 최적화된 SpRY 매개 아데닌 염기 편집기(ABE), zSpRY-ABE8e 및 합성 변형 gRNA를 제브라피쉬에 적용하면 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌-구아닌 염기 전환이 가능해졌습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬에서 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 위한 프로토콜입니다. zSpRY-ABE8e mRNA와 합성 변형 gRNA의 혼합물을 제브라피쉬 배아에 주입하여 TSR2 리보솜 성숙 인자(tsr2)의 병원성 부위를 시뮬레이션하는 정확한 돌연변이로 제브라피쉬 질병 모델을 구성했습니다. 이 방법은 질병 메커니즘 및 치료법을 연구하기 위한 정확한 질병 모델을 확립하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 유발하는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)는 인간 게놈1에서 가장 흔한 돌연변이 원인입니다. 특정 SNV가 병원성인지 여부를 확인하고 발병기전을 밝히기 위해서는 정확한 동물모델이 필요하다2. 제브라피쉬는 인간과 높은 수준의 생리적, 유전적 상동성, 짧은 발달 주기, 강력한 생식 능력을 나타내는 우수한 인간 질병 모델로, 병원성 특성 및 메커니즘에 대한 연구와 약물 스크리닝에 유리합니다3.
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 제브라피시4를 포함한 다양한 종의 게놈 편집에 널리 적용되었습니다. gRNA 유도를 통해 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 부위에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있으며, 이는 상동성 지향 복구(HDR) 경로를 통해 표적 부위와 기증자 DNA 템플릿의 재조합을 통해 단일 염기 치환을 가능하게 합니다. 그러나, 이 염기 치환 방법의 효율은 매우 낮은데, 이는 세포 DNA 복구 과정이 주로 삽입 및 결실(indel) 돌연변이를 동반하는 비상동 말단 결합(non-homologous end-joining, NHEJ) 경로에 의해 수행되기 때문이다5. 다행스럽게도 CRISPR/Cas9 기반 단일 염기 편집 기술은 DSB를 유도하지 않고도 보다 효율적인 단일 염기 편집이 가능한 염기 편집기를 사용하여 이 문제를 크게 완화합니다. 염기 편집기의 두 가지 주요 클래스인 아데닌 염기 편집자(ABE)와 시토신 염기 편집자(CBE)는 A· T에서 G· C와 C·G에서 T· A는 각각 6,7,8,9,10,11이다. 이 4가지 유형의 염기 치환은 인간 병원성 변이체의 30%를 차지한다12. PmCDA1, BE 시스템, CBE4max, ABE7.10 및 ABE8e를 포함한 두 종류의 기본 편집기는 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 특히 BE4max 및 ABE8e는 높은 편집 활동 13,14,15,16,17,18,19를 달성하는 것으로 보고되었습니다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 큰개자리 개(S. canis)를 포함한 다양한 종의 Cas9 단백질이 제브라피쉬 유전자 편집에 구현되었으며, Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)가 가장 널리 사용되고 있습니다 20,21,22,23. 그러나, SpCas9는 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 있는 표적 부위만 인식할 수 있으며, 이는 편집 가능한 범위를 제한하고 병원성 관심 부위 근처에서 적절한 서열을 발견하지 못하게 할 수 있다24. 목표 범위를 확장하기 위해 다양한 SpCas9 변형이 유도 진화 및 구조 유도 설계를 통해 다양한 PAM을 인식하도록 설계되었습니다. 그러나 동물, 특히 제브라피쉬에서 효과적인 변종은 거의 없으며, 이는 SNV 관련 질병 연구에서 제브라피쉬의 적용을 제한합니다25,26,27,28. 최근에, 덜 엄격한 PAM 제한(NYN보다 NRN에 대한 선호도가 더 높은 SpG에 대한 NGN 및 SpRY에 대한 NNN)을 갖는 SpCas9, SpG 및 SpRY의 두 가지 변이체가 인간 세포 및 식물에서 높은 편집 활성을 나타내는 것으로 보고되었습니다 29,30,31,32. 그 후, SpG 및 SpRY뿐만 아니라 SpRY 매개 CBE 및 SpRY 매개 ABE와 같은 다수의 중재 기본 편집기도 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 이는 SNV 관련 질병의 기계론적 연구 및 약물 스크리닝에서 제브라피쉬 모델의 적용을 향상시킬 것입니다 18,33,34,35. 또한, i-Silence는 ATG에서 GTG 또는 ACG36으로의 ABE 매개 시작 코돈 전환을 통해 효과적이고 정확한 유전자 녹아웃 전략으로 제안되었습니다. i-Silence 전략과 SpRY 매개 베이스 편집기 zSpRY-ABE8e의 조합은 질병 모델링을 위한 새로운 방법을 제공한다(18). 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 zSpRY-ABE8e를 사용하여 유전자 편집을 수행하여 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 모델을 구성하는 방법을 보여줍니다. 제브라피쉬 모델에 나타나는 편집 효율성과 표현형을 평가하고 분석했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 기본 편집기 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬 질병 모델을 구성하는 방법을 설명합니다. 염기 치환을 위한 기존 HDR 경로와 비교할 때 이 프로토콜은 보다 효율적인 염기 편집을 달성하고 인델 발생을 줄일 수 있습니다. 동시에, 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 최근에 제안된 i-Silence 유전자 녹아웃 전략을 구현하는 것을 포함합니다. 종합하면, zSpRY-ABE8e는 질병 연구에서 제브라피쉬 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고 초안의 영어 텍스트를 편집해 주신 Liwen Bianji(Edanz)의 Barbara Garbers 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 광둥성 핵심 지역 연구 개발 프로그램(2019B030335001), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2019YFE0106700), 중국 국립 자연 과학 재단(32070819, 31970782), 광둥성 수생 경제 동물을 위한 병원성 생물학 및 역학 핵심 연구소의 연구 기금 프로그램(PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
Riferimenti
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
