Эффективное редактирование базы без PAM для моделирования генетических заболеваний человека у рыбок данио-рерио с помощью zSpRY-ABE8e
Summary
Этот протокол описывает, как выполнить эффективное редактирование аденинового основания без ограничения PAM для построения точной модели болезни рыбок данио-рерио с использованием zSpRY-ABE8e.
Abstract
Технология CRISPR/Cas9 повысила ценность рыбок данио-рерио для моделирования генетических заболеваний человека, изучения патогенеза заболеваний и скрининга лекарств, но ограничения смежных мотивов протоспейсеров (PAM) являются основным препятствием для создания точных животных моделей генетических нарушений человека, вызванных однонуклеотидными вариантами (SNV). До сих пор некоторые варианты SpCas9 с широкой совместимостью с PAM показали эффективность у рыбок данио. Применение оптимизированного SpRY-опосредованного редактора адениновых оснований (ABE), zSpRY-ABE8e и синтетически модифицированной гРНК у рыбок данио-рерио позволило эффективно конформировать аденин-гуаниновое основание без ограничения PAM. Здесь описан протокол для эффективного редактирования адениновых оснований без ограничения PAM у рыбок данио-рерио с использованием zSpRY-ABE8e. Путем введения смеси мРНК zSpRY-ABE8e и синтетически модифицированной гРНК эмбрионам рыбок данио-рерио была построена модель болезни рыбок данио-рерио с точной мутацией, которая имитировала патогенный сайт фактора созревания рибосомы TSR2 (tsr2). Этот метод является ценным инструментом для создания точных моделей заболеваний для изучения механизмов и методов лечения заболеваний.
Introduction
Однонуклеотидные варианты (SNV), вызывающие миссенсовые или нонсенсовые мутации, являются наиболее распространенным источником мутаций в геноме человека1. Чтобы определить, является ли конкретная SNV патогенной, и пролить свет на ее патогенез, требуются точные модели на животных2. Рыбки данио-рерио являются хорошими моделями болезней человека, демонстрируя высокую степень физиологической и генетической гомологии с людьми, короткий цикл развития и сильную репродуктивную способность, что выгодно для исследования патогенных характеристик и механизмов, а также скрининга лекарств3.
Кластерная система коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas9 с регулярным интервалом широко применяется при редактировании генома различных видов, включая рыбок данио-рерио4. Под руководством гРНК система CRISPR/Cas9 может генерировать двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) на целевом участке, что затем позволяет заменять одно основание путем рекомбинации целевого сайта с донорскими матрицами ДНК через путь репарации, направленной на гомологию (HDR). Однако эффективность этого метода замещения оснований довольно низкая, поскольку процесс репарации клеточной ДНК в основном осуществляется путем негомологичного соединения концов (NHEJ), который обычно сопровождается мутациями вставки и делеции (индел)5. К счастью, технология редактирования одной базы на основе CRISPR/Cas9 значительно облегчает эту проблему за счет использования базовых редакторов, которые обеспечивают более эффективное редактирование одной базы без индуцирования DSB. Два основных класса редакторов оснований, редакторы адениновых оснований (ABE) и редакторы цитозиновых оснований (CBE), были разработаны для реализации редактирования с заменой оснований для A· T в G· C и C·G в T· А, соответственно 6,7,8,9,10,11. Эти четыре типа замещения оснований охватывают 30% патогенных вариантов человека12. Сообщалось, что оба класса базовых редакторов, включая PmCDA1, систему BE, CBE4max, ABE7.10 и ABE8e, работают с рыбками данио, причем особенно сообщается, что BE4max и ABE8e достигают высокой активности редактирования 13,14,15,16,17,18,19.
Белки Cas9 различных видов, включая Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и S. canis, были реализованы при редактировании генов рыбок данио, при этом наиболее широко используется Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)20,21,22,23. Тем не менее, SpCas9 может распознавать целевые сайты только с примыкающим к NGG протоспейсером мотивом (PAM), что ограничивает его редактируемый диапазон и может привести к тому, что подходящая последовательность не будет найдена вблизи патогенного сайта, представляющегоинтерес 24. Чтобы расширить целевой диапазон, было разработано множество вариантов SpCas9 для распознавания различных PAM посредством направленной эволюции и структурно-ориентированного проектирования. Тем не менее, немногие варианты эффективны для животных, особенно для рыбок данио, что ограничивает применение рыбок данио-рерио в исследованиях заболеваний, связанных с SNV 25,26,27,28. В последнее время сообщалось, что два варианта SpCas9, SpG и SpRY с менее строгими ограничениями PAM (NGN для SpG и NNN для SpRY с более высоким предпочтением NRN, чем NYN), проявляют высокую активность редактирования в клетках и растениях человека 29,30,31,32. Впоследствии сообщалось, что SpG и SpRY, а также ряд их опосредованных базовых редакторов, таких как SpRY-опосредованные CBE и SpRY-опосредованные ABE, также работают с рыбками данио, что расширит применение моделей рыбок данио-рерио в механистическом исследовании и скрининге лекарств заболеваний, связанных с SNV 18,33,34,35. Кроме того, i-Silence был предложен в качестве эффективной и точной стратегии нокаута генов посредством ABE-опосредованного преобразования стартового кодона из ATG в GTG или ACG36. Комбинация стратегии i-Silence и SpRY-опосредованного базового редактора zSpRY-ABE8e обеспечивает новый метод моделирования заболеваний18. Этот протокол демонстрирует, как выполнять редактирование генов с использованием zSpRY-ABE8e у рыбок данио-рерио для построения модели tsr2 (M1V) с использованием стратегии i-Silence. Была оценена и проанализирована эффективность редактирования и фенотипы, которые появляются в моделях рыбок данио.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описано построение модели болезни рыбок данио-рерио с использованием базового редактора zSpRY-ABE8e. По сравнению с традиционным путем HDR для замены базы, этот протокол может обеспечить более эффективное редактирование базы и уменьшить количество инделов. В то же время это?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Барбару Гарберс, доктора философии из Liwen Bianji (Edanz), за редактирование английского текста черновика этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой исследований и разработок в ключевых областях провинции Гуандун (2019B030335001), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2019YFE0106700), Национальным фондом естественных наук Китая (32070819, 31970782) и Программой исследовательского фонда Ключевой лаборатории патогенной биологии и эпидемиологии водных экономических животных провинции Гуандун (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
Riferimenti
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
