zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme
Summary
Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.
Abstract
CRISPR / Cas9 teknolojisi, insan genetik hastalıklarının modellenmesi, hastalık patogenezinin incelenmesi ve ilaç taraması için zebra balıklarının değerini artırmıştır, ancak protospacer bitişik motif (PAM) sınırlamaları, tek nükleotid varyantlarının (SNV’ler) neden olduğu insan genetik bozukluklarının doğru hayvan modellerini oluşturmanın önündeki en büyük engeldir. Şimdiye kadar, geniş PAM uyumluluğuna sahip bazı SpCas9 varyantları zebra balıklarında verimlilik göstermiştir. Zebra balığında optimize edilmiş SpRY aracılı adenin baz editörü (ABE), zSpRY-ABE8e ve sentetik olarak modifiye edilmiş gRNA’nın uygulanması, PAM kısıtlaması olmadan verimli adenin-guanin baz dönüşümü sağlamıştır. Burada açıklanan, zSpRY-ABE8e kullanan zebra balıklarında PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesi için bir protokoldür. Zebra balığı embriyolarına zSpRY-ABE8e mRNA ve sentetik olarak modifiye edilmiş gRNA’nın bir karışımı enjekte edilerek, TSR2 ribozom olgunlaşma faktörünün (tsr2) patojenik bir bölgesini simüle eden hassas bir mutasyonla bir zebra balığı hastalık modeli oluşturuldu. Bu yöntem, hastalık mekanizmalarını ve tedavilerini incelemek için doğru hastalık modellerinin oluşturulması için değerli bir araç sağlar.
Introduction
Yanlış veya saçma sapan mutasyonlara neden olan tek nükleotid varyantları (SNV’ler), insan genomu1’deki en yaygın mutasyon kaynağıdır. Belirli bir SNV’nin patojenik olup olmadığını belirlemek ve patogenezine ışık tutmak için kesin hayvan modelleri gereklidir2. Zebra balığı, insanlarla yüksek derecede fizyolojik ve genetik homoloji, kısa bir gelişimsel döngü ve patojenik özellikler ve mekanizmaların araştırılması ve ilaç taraması için avantajlı olan güçlü üreme yeteneği sergileyen iyi insan hastalığı modelleridir3.
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / Cas9 sistemi, zebra balığı4 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin genom düzenlenmesinde yaygın olarak uygulanmıştır. gRNA rehberliğinde, CRISPR / Cas9 sistemi hedef bölgede DNA çift sarmallı kırılmalar (DSB’ler) üretebilir, bu da hedef bölgenin homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu aracılığıyla donör DNA şablonlarıyla rekombinasyonu yoluyla tek baz ikamesine izin verir. Bununla birlikte, bu baz replasman yönteminin etkinliği oldukça düşüktür, çünkü hücresel DNA onarım işlemi esas olarak genellikle yerleştirme ve silme (indel) mutasyonlarının eşlik ettiği homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yolu tarafından gerçekleştirilir5. Neyse ki, CRISPR / Cas9 tabanlı tek tabanlı düzenleme teknolojisi, DSB’leri tetiklemeden daha verimli tek tabanlı düzenlemeye olanak tanıyan temel editörleri kullanarak bu sorunu önemli ölçüde hafifletir. İki ana baz editör sınıfı, adenin baz editörleri (ABE’ler) ve sitozin baz editörleri (CBE’ler), A · için baz ikame düzenlemesini uygulamak üzere geliştirilmiştir. T’den G· C ve C·G’den T·’ye A, sırasıyla 6,7,8,9,10,11. Bu dört tip baz ikamesi, insan patojenik varyantlarının% 30’unu kapsar12. PmCDA1, BE sistemi, CBE4max, ABE7.10 ve ABE8e dahil olmak üzere her iki temel editör sınıfının zebra balıklarında çalıştığı bildirilmiştir; BE4max ve ABE8e’nin özellikle yüksek düzenleme aktivitesi 13,14,15,16,17,18,19 elde ettiği bildirilmiştir.
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ve S. canis dahil olmak üzere farklı türlerden Cas9 proteinleri, zebra balığı gen düzenlemesinde uygulanmış, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) en yaygın olarak20,21,22,23 olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, SpCas9 yalnızca düzenlenebilir aralığını sınırlayan ve ilgilenilen patojenik alanın yakınında uygun bir sekansın bulunamamasına neden olabilen bir NGG protospacer bitişik motifi (PAM) olan hedef bölgeleri tanıyabilir24. Hedef aralığı genişletmek için, yönlendirilmiş evrim ve yapı kılavuzlu tasarım yoluyla farklı PAM’leri tanımak için çeşitli SpCas9 varyantları tasarlanmıştır. Bununla birlikte, hayvanlarda, özellikle zebra balıklarında, SNV ile ilişkili hastalık araştırmalarında zebra balıklarının uygulanmasını sınırlayan az sayıda varyant etkilidir25,26,27,28. Son zamanlarda, SpCas9, SpG ve SpRY’nin daha az katı PAM kısıtlamalarına sahip iki varyantının (SpG için NGN ve SpRY için NNN, NRN’yi NYN’den daha yüksek bir tercihle) insan hücrelerinde ve bitkilerde yüksek düzenleme aktivitesi sergilediği bildirilmiştir 29,30,31,32. Daha sonra, SpG ve SpRY’nin yanı sıra SpRY aracılı CBE’ler ve SpRY aracılı ABE’ler gibi bir dizi aracılı temel editörünün, zebra balığı modellerinin SNV ile ilişkili hastalıkların mekanik çalışmasında ve ilaç taramasında uygulanmasını artıracakolan zebra balıklarında çalıştığı bildirilmiştir 18,33,34,35 . Ayrıca, i-Silence, ATG’den GTG’ye veya ACG36’ya ABE aracılı başlangıç kodonu dönüşümü yoluyla etkili ve doğru bir gen nakavt stratejisi olarak önerilmiştir. i-Silence stratejisi ve SpRY aracılı temel editör zSpRY-ABE8e’nin kombinasyonu, hastalık modellemesi18 için yeni bir yöntem sağlar. Bu protokol, i-Silence stratejisini kullanarak bir tsr2 (M1V) modeli oluşturmak için zebra balığında zSpRY-ABE8e kullanarak gen düzenlemenin nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. Zebra balığı modellerinde ortaya çıkan düzenleme verimliliği ve fenotipler değerlendirilmiş ve analiz edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, zSpRY-ABE8e temel editörünü kullanarak bir zebra balığı hastalık modelinin oluşturulmasını açıklar. Temel değiştirme için geleneksel HDR yolu ile karşılaştırıldığında, bu protokol daha verimli temel düzenleme sağlayabilir ve indel oluşumunu azaltabilir. Aynı zamanda, bu protokol zebra balıklarında yakın zamanda önerilen i-Silence gen nakavt stratejisinin uygulanmasını içerir. Birlikte ele alındığında, zSpRY-ABE8e, zebra balığı modellerinin hastalık araştırmalarınd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Liwen Bianji’den (Edanz) Dr. Barbara Garbers’a bu el yazmasının taslağının İngilizce metnini düzenlediği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Anahtar Alan Araştırma ve Geliştirme Programı (2019B030335001), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2019YFE0106700), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32070819, 31970782) ve Guangdong Eyaleti Sucul Ekonomik Hayvanlar için Patojenik Biyoloji ve Epidemiyoloji Anahtar Laboratuvarı Araştırma Fonu Programı (PBEA2020YB05) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
Riferimenti
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
