JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Hypotalamiska kisspeptin neuroner som ett mål för helcell patch-clamp inspelningar

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64989
, , ,
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas,Universidade de Sao Paulo

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en helcellspatchklämma på hjärnskivor innehållande kisspeptinneuroner, den primära modulatorn av gonadotropinfrisättande hormonceller (GnRH). Genom att lägga till kunskap om kisspeptin neuronaktivitet har detta elektrofysiologiska verktyg fungerat som grund för betydande framsteg inom neuroendokrinologiområdet under de senaste 20 åren.

Abstract

Kisspeptiner är viktiga för mognad av hypotalamus-hypofys-gonadaxeln (HPG) och fertilitet. Hypotalamiska kisspeptinneuroner belägna i den anteroventrala periventrikulära kärnan och rostrala periventrikulära kärnan, liksom hypotalamus bågformiga kärna, projicerar bland annat gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) neuroner. Tidigare studier har visat att kisspeptinsignalering sker genom Kiss1-receptorn (Kiss1r), vilket i slutändan är spännande GnRH-neuronaktivitet. Hos människor och experimentella djurmodeller är kisspeptiner tillräckliga för att inducera GnRH-utsöndring och följaktligen frisättning av luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH). Eftersom kisspeptiner spelar en viktig roll i reproduktiva funktioner arbetar forskare för att bedöma hur den inneboende aktiviteten hos hypotalamiska kisspeptinneuroner bidrar till reproduktionsrelaterade åtgärder och identifierar de primära neurotransmittorerna / neuromodulatorerna som kan förändra dessa egenskaper. Helcellspatch-clamp-tekniken har blivit ett värdefullt verktyg för att undersöka kisspeptinneuronaktivitet i gnagarceller. Denna experimentella teknik gör det möjligt för forskare att registrera och mäta spontana excitatoriska och hämmande jonströmmar, vilande membranpotential, åtgärdspotentialbränning och andra elektrofysiologiska egenskaper hos cellmembran. I den aktuella studien granskas avgörande aspekter av helcellspatch-clamp-tekniken, så kallade elektrofysiologiska mätningar som definierar hypotalamiska kisspeptinneuroner, och en diskussion om relevanta frågor om tekniken.

Introduction

Hodgkin och Huxley gjorde den första intracellulära registreringen av en åtgärdspotential som beskrivs i flera vetenskapliga studier. Denna inspelning utfördes på bläckfiskaxonen, som har en stor diameter (~ 500 μm), vilket gör att en mikroelektrod kan placeras inuti axonen. Detta arbete gav stora möjligheter till vetenskaplig forskning, som senare kulminerade i skapandet av spänningsklämläget, som användes för att studera den joniska grunden för aktionspotentialgenerering 1,2,3,4,5,6,7,8. Under åren har tekniken förbättrats och den har blivit allmänt tillämpad i vetenskaplig forskning 6,9. Uppfinningen av patch-clamp-tekniken, som ägde rum i slutet av 1970-talet genom studier initierade av Erwin Neher och Bert Sakmann, gjorde det möjligt för forskare att registrera enstaka jonkanaler och intracellulära membranpotentialer eller strömmar i praktiskt taget alla typer av celler med endast en enda elektrod 9,10,11,12 . Patch-clamp-inspelningar kan göras på en mängd olika vävnadspreparat, såsom odlade celler eller vävnadsskivor, antingen i spänningsklämläge (håller cellmembranet vid en inställd spänning som möjliggör registrering av t.ex. spänningsberoende strömmar och synaptiska strömmar) eller strömklämläge (vilket möjliggör registrering av t.ex. förändringar i vilomembranpotential inducerad av jonströmmar, åtgärdspotentialer och postsynaptisk potentialfrekvens).

Användningen av patch-clamp-tekniken gjorde flera anmärkningsvärda upptäckter möjliga. Faktum är att de seminala fynden om de elektrofysiologiska egenskaperna hos hypotalamiska kisspeptinneuroner belägna vid de anteroventrala periventrikulära och rostrala periventrikulära kärnorna (AVPV / PeN Kisspeptin), även känd som det rostrala periventrikulära området i den tredje ventrikeln (RP3V), och den bågformiga kärnan i hypotalamus (ARHkisspeptin)13,14,15 är av särskilt intresse. År 2010 utförde Ducret et al. de första inspelningarna av AVPV / PeNKisspeptinneuroner i möss med hjälp av ett annat elektrofysiologiskt verktyg, löscellig patch-clamp-teknik. Dessa studier gav en elektrisk beskrivning av AVPV / PeNKisspeptin neuroner och visade att deras bränningsmönster är estrous cykelberoende16. År 2011 använde Qiu et al. hela cellpatch-clamp-tekniken för att visa att ARHkisspeptin neuroner uttrycker endogena pacemakerströmmar17. Därefter visade Gottsch et al. att kisspeptinneuroner uppvisar spontan aktivitet och uttrycker både h-typ (pacemaker) och T-typ kalciumströmmar, vilket tyder på attARH-kisspeptinneuroner delar elektrofysiologiska egenskaper med andra pacemakerneuroner i centrala nervsystemet18. Dessutom har det visats attARH-kisspeptinneuroner uppvisar sexuellt dimorfa avfyrningshastigheter och att AVPV / PeNKisspeptin-neuroner uppvisar en bimodal vilomembranpotential (RMP) påverkad av ATP-känsliga kaliumkanaler (KATP)19,20. Vidare fastställdes att gonadala steroider positivt påverkar den spontana elektriska aktiviteten hos kisspeptinneuronerna hos möss 19,20,21. De första verken som studerar kisspeptin neurons elektrofysiologiska egenskaper nämns 16,17,18,19,20. Sedan dess har många studier använt helcellspatch-clamp-tekniken för att visa vilka faktorer / neuromodulatorer som är tillräckliga för att modulera den elektriska aktiviteten hos kisspeptinneuroner (figur 1) 17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Med tanke på vikten av denna teknik för studier av neuroner som krävs för reproduktion, bland andra celltyper som inte omfattas här, beskriver denna artikel de grundläggande stegen för utveckling av helcellspatch-clamp-tekniken, såsom att förbereda lösningarna, dissekera och skära hjärnan och utföra cellmembranets tätning för inspelningar. Dessutom diskuteras relevanta frågor om tekniken, såsom dess fördelar, tekniska begränsningar och viktiga variabler som måste kontrolleras för optimal experimentell prestanda.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Institute of Biomedical Sciences Animal Ethics Committee vid University of São Paulo och utfördes enligt de etiska riktlinjer som antagits av Brazilian College of Animal Experimentation. 1. Beredning av lösningar Framställning av intern lösningOBS: Den interna lösningen fyller patchklämmikropipetten och kommer i kontakt med cellens inre (se ett exempel i figur 2). Interna lösningar kan variera …

Representative Results

För att studera de möjliga effekterna av humant rekombinant tillväxthormon (hGH) på aktiviteten hos hypotalamiska kisspeptinneuroner utförde vi helcellspatch-clamp-inspelningar i hjärnskivor och bedömde om detta hormon orsakar akuta förändringar i aktiviteten hos AVPV / PeN Kisspeptin och ARHkisspeptin neuroner. Vuxna Kiss1-Cre/GFP hona (diestrus-stadium) och hanmöss36 användes i denna studie. Gonad-intakta djur valdes ut för experimenten, eftersom egenskaperna h…

Discussion

Utvecklingen av helcellstekniken hade en betydande inverkan på det vetenskapliga samfundet och ansågs vara av största vikt för att utveckla vetenskaplig forskning och möjliggöra flera upptäckter. Dess inverkan på vetenskapen var tillräcklig för att kulminera i Nobelpriset i medicin 1991, eftersom denna upptäckt öppnade dörren till en bättre förståelse för hur jonkanaler fungerar under fysiologiska och patologiska förhållanden, samt identifiering av potentiella mål för terapeutiska medel 11,39,40,41<s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av São Paulo Research Foundation [FAPESP-bidragsnummer: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); och av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Finance Code 001″ (HRV).

Materials

Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various –
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus – can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices – Commander Software
LAS X wide field system Leica – Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various –
cyanoacrylate glue LOCTITE/various –
Decapitation scissors various –
Filter paper various –
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various –
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various –
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscienze. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

Whole-cell Patch-clamp RecordingsElectrophysiological PropertiesCell MembranesIonic CurrentsCellular ResponseBrain DissectionHypothalamusOptic NerveVibratomeACSF SolutionMicroscopeAmplifierDigitizerMicromanipulatorPerfusion Pump
check_url/it/64989?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image