Generering af genetisk modificerede Plasmodium berghei sporozoitter

Summary

Malaria overføres gennem podning af sporozoitstadiet af Plasmodium af inficerede myg. Transgen Plasmodium har gjort det muligt for os at forstå malariaens biologi bedre og har bidraget direkte til udviklingen af malariavacciner. Her beskriver vi en strømlinet metode til at generere transgene Plasmodium berghei sporozoitter.

Abstract

Malaria er en dødelig sygdom forårsaget af parasitten Plasmodium og overføres gennem bid af kvindelige Anopheles myg. Det sporozoitiske stadium af Plasmodium deponeret af myg i huden hos hvirveldyrværter gennemgår en fase med obligatorisk udvikling i leveren, inden klinisk malaria påbegyndes. Vi ved lidt om biologien bag Plasmodiums udvikling i leveren; adgang til sporozoitstadiet og evnen til genetisk modifikation af sådanne sporozoitter er kritiske værktøjer til at studere arten af Plasmodium-infektion og det resulterende immunrespons i leveren. Her præsenterer vi en omfattende protokol til generering af transgene Plasmodium berghei sporozoitter. Vi genetisk modificerer blodstadiet P. berghei og bruger denne form til at inficere Anopheles myg, når de tager et blodmåltid. Efter at de transgene parasitter har gennemgået udvikling i myggene, isolerer vi parasittens sporozoitstadium fra myggens spytkirtler til in vivo – og in vitro-forsøg . Vi demonstrerer protokollens gyldighed ved at generere sporozoitter af en ny stamme af P. berghei , der udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP) underenhed 11 (GFP₁₁), og viser, hvordan det kan bruges til at undersøge biologien bag malaria i leverstadiet.

Introduction

På trods af fremskridt inden for lægemiddeludvikling og forskning i malariaforebyggelse og -behandling er den globale sygdomsbyrde ved malaria fortsat høj. Over en halv million mennesker dør af malaria hvert år, med de højeste niveauer af dødelighed set blandt børn, der bor i malaria-endemiske regioner, såsom Afrika syd for Sahara¹. Malaria er forårsaget af parasitten Plasmodium, som overføres til mennesker gennem bid af kvindelige Anopheles myg, der bærer parasitten i deres spytkirtler. Det infektiøse stadium af Plasmodium – sporozoitterne – deponeres i hvirveldyrværternes hud under et blodmåltid og rejser gennem blodbanen for at inficere leverceller, hvor de gennemgår obligatorisk udvikling (udgør præerythrocytisk malaria) inden infektion af erytrocytterne. Infektionen af erytrocytterne initierer malariaens blodstadium og er ansvarlig for hele sygeligheden og dødeligheden forbundet med sygdommen ^2,3.

Den obligatoriske karakter af den præerythrocytiske udvikling af Plasmodium har gjort det til et attraktivt mål for profylaktisk vaccine- og lægemiddeludviklingsindsats⁴. En forudsætning for at studere biologien af præerythrocytisk malaria samt udviklingen af vacciner eller lægemidler rettet mod leverstadiet er adgang til Plasmodium sporozoitter. Desuden har vores evne til at generere genetisk modificerede Plasmodium sporozoitter været medvirkende til succesen med sådanne forskningsbestræbelser 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodium-linjer, der udtrykker fluorescerende eller selvlysende reporterproteiner, har gjort det muligt for os at spore deres udvikling in vivo og in vitro^10,11. Genetisk svækkede parasitter (GAPs), genereret ved sletning af flere gener i Plasmodium, er også nogle af de mest lovende vaccinekandidater^12,13.

Malariamodeller for gnavere og ikke-menneskelige primater har hjulpet os med at forstå mekanismerne for værtsparasitinteraktioner i human malaria på grund af lighederne i biologi og livscyklus blandt Plasmodium-arter ¹⁴. Brugen af Plasmodium-arter, der inficerer gnavere, men ikke mennesker (f.eks. P. berghei), tillader opretholdelse af den komplette parasitlivscyklus og generering af infektiøse sporozoitter til undersøgelse af malaria i leverstadiet i en kontrolleret biosikkerhedsniveau 1-indstilling. Der findes allerede en række separate protokoller til generering af transgene blodstadiet Plasmodium-parasitter 15, infektion af myg¹⁶ og isolering af sporozoitter¹⁷. Her skitserer vi en omfattende protokol, der kombinerer disse metoder for at generere og isolere transgene P. berghei-sporozoitter ved hjælp af den nye transgene stamme PbGFP₁₁ som et eksempel. PbGFP 11 smugler den 11. β-streng af supermappegrønt fluorescerende protein (GFP), GFP₁₁, ind i den parasitoforøse vakuol (PV), der genereres i værtshepatocytterne. PbGFP 11 anvendes sammen med transgene hepatocytter (Hepa1-6 baggrund), der udtrykker rester, der udgør GFP 1-10-fragmentet (GFP 1-10) i cytoplasmaet (Hepa GFP _1-10 celler). PbGFP₁₁ rapporterer PV-lyse i værtshepatocytterne gennem selvkomplementarisering og reformation af funktionel GFP og det grønne fluorescenssignal¹⁸. Bemærk, at GFP 11 er kodet som en serie på syv tandemsekvenser i PbGFP₁₁ for at forbedre det resulterende fluorescenssignal. Ved farvning af PbGFP₁₁ sporozoitter med det cytoplasmatiske farvestof CellTrace Violet (CTV) kan vi spore parasitterne. Lysen af sådanne CTV-farvede intracellulære parasitter resulterer i sig selv i lækage af CTV i værtscellecytoplasmaet og farvning af værtscellen. Ud over at visualisere og skelne lysis af Plasmodium PV og / eller parasitten i værtshepatocytter kan dette system pålideligt bruges til at studere immunveje, der er ansvarlige for en af disse processer, gennem den genetiske eller terapeutiske forstyrrelse af de molekylære komponenter i sådanne veje.

Protocol

Al forskning, der involverer hvirveldyr i vores laboratorium, blev udført i overensstemmelse med University of Georgias retningslinjer og protokoller for dyrebrug. 1. Generering af P. berghei-inficerede mus Start infektion i blodstadiet hos han- eller hunmus, 6-8 uger gamle C57BL/6 (B6) ved hjælp af vildtype P. berghei-parasitter. For at gøre dette overføres kryopræserveret P. berghei-inficeret blod (2 x 105 inficerede RBC’…

Representative Results

Bestemmelse af hyppigheden og udviklingen af schizonts er afgørende for at sikre, at nok levedygtige parasitter er i det optimale stadium til transfektion. Umodne skizonter kan differentieres fra fuldt modne schizonts ved tilstedeværelsen af færre merozoitter, der ikke fylder hele RBC’s intracellulære rum (figur 1B). Det er vigtigt at bemærke, at når der foretages blodudstrygninger fra dyrket blod, kan inficerede RBC’er bryde op, hvilket resulterer i observation af frie, ekstracellulæ…

Discussion

Vi har brugt ovenstående protokol i vores laboratorium til at skabe flere linjer af transgene P. berghei parasitter. Selvom optimeret til P. berghei, har vi også med succes brugt denne protokol til at generere transgene P. yoelii sporozoitter. Efter injektion af de transfekterede skizonter i mus kan parasitter påvises typisk senest 3 d.p.i. i alle grupper, herunder ingen plasmidkontrol. Selektion påbegyndes først, når parasitæmi er blevet påvist for at sikre parasitternes levedygtighed …

Materials

30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II – Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3