La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .
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Articolo metodologico
Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malaria è una malattia mortale causata dal parassita Plasmodium e si trasmette attraverso la puntura delle zanzare femmine di zanzara Anopheles . Lo stadio sporozooitico di Plasmodium depositato dalle zanzare nella pelle degli ospiti vertebrati subisce una fase di sviluppo obbligatorio nel fegato prima di iniziare la malaria clinica. Sappiamo poco sulla biologia dello sviluppo del Plasmodium nel fegato; l'accesso allo stadio di sporozoite e la capacità di modificare geneticamente tali sporozoiti sono strumenti fondamentali per studiare la natura dell'infezione da Plasmodium e la conseguente risposta immunitaria nel fegato. Qui presentiamo un protocollo completo per la generazione di sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei . Modifichiamo geneticamente P. berghei allo stadio sanguigno e usiamo questa forma per infettare le zanzare Anopheles quando assumono un pasto di sangue. Dopo che i parassiti transgenici si sono sviluppati nelle zanzare, isoliamo lo stadio di sporozoite del parassita dalle ghiandole salivari della zanzara per la sperimentazione in vivo e in vitro . Dimostriamo la validità del protocollo generando sporozoiti di un nuovo ceppo di P. berghei che esprime la subunità 11 della proteina fluorescente verde (GFP) (GFP11) e mostriamo come potrebbe essere utilizzato per studiare la biologia della malaria allo stadio epatico.
Introduzione
Nonostante i progressi nello sviluppo di farmaci e nella ricerca sulla prevenzione e il trattamento della malaria, il carico globale di malattia della malaria rimane elevato. Oltre mezzo milione di persone muoiono di malaria ogni anno, con i più alti livelli di mortalità osservati tra i bambini che vivono in regioni endemiche per la malaria, comel'Africa sub-sahariana. La malaria è causata dal parassita Plasmodium, che viene trasmesso all'uomo attraverso la puntura di zanzare Anopheles femmine che portano il parassita nelle loro ghiandole salivari. Lo stadio infettivo del Plasmodium, gli sporozoi....
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Protocollo
Tutte le ricerche che hanno coinvolto animali vertebrati nel nostro laboratorio sono state eseguite in conformità con le linee guida e i protocolli per l'uso degli animali dell'Università della Georgia.
1. Generazione di topi infetti da P. berghei
- Avviare l'infezione allo stadio ematico in topi C57BL/6 (B6) maschi o femmine di 6-8 settimane utilizzando parassiti selvatici di P. berghei. Per fare ciò, trasferire sangue crioconservato infetto da P. berghei (2 x 105 globuli rossi infetti), ricostituito in 400 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), in uno o due topi ....
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Risultati
Determinare la frequenza e lo sviluppo degli schizonti è fondamentale per garantire che un numero sufficiente di parassiti vitali si trovi nella fase ottimale per la trasfezione. Gli schizonti immaturi possono essere differenziati dagli schizonti completamente maturi per la presenza di un minor numero di merozoiti che non riempiono l'intero spazio intracellulare dei globuli rossi (Figura 1B). È importante notare che quando si eseguono strisci di sangue da sangue coltivato, i globuli rossi in.......
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Discussione
Abbiamo utilizzato il protocollo di cui sopra nel nostro laboratorio per creare diverse linee di parassiti transgenici P. berghei. Sebbene ottimizzato per P. berghei, abbiamo anche utilizzato con successo questo protocollo per generare sporozoiti transgenici di P. yoelii. Dopo aver iniettato gli schizonti trasfettati nei topi, i parassiti sono rilevabili in genere non più tardi di 3 d.p.i. in tutti i gruppi, compreso il controllo senza plasmidi. La selezione viene avviata solo una volta che la .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health AI168307 a SPK. Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso UGA CTEGD e il nucleo di microscopia UGA CTEGD. Riconosciamo anche i contributi di Ash Pathak, Anne Elliot e dello staff di UGA Sporocore nell'ottimizzazione del protocollo. Vogliamo ringraziare il Dr. Daichi Kamiyama per le preziose intuizioni, la discussione e i plasmidi genitori contenenti GFP11 e GFP 1-10. Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Kurup per il loro costante supporto, pazienza e incoraggiamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 30 G x 1/2" Ago per siringa | Exel international | 26437 | |
| Soluzione di Alsever | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoetanolo) | TCI America | T1420 | |
| Provette per la raccolta del sangue | BD | bioscience 365967 | per prelievo di siero |
| Ematocitometro monouso C-Chip | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Piatto per colture cellulari | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuga 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuga 5910R | Eppendorf | 5910R | Per centrifugazione in gradiente |
| Delta Vision II - Sistema di microscopio invertito | Olympus | IX-71 | |
| Dimetil solfossido Sigma | D5879-500ml | ||
| Siero fetale bovino | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmide | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generato da PL0017 |
| plasmide Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cellule | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generato da cellule Hepa 1-6 (ATCC Cat# CRL-1830) |
| di topo | utilizzato per terreni di dissezione delle zanzare | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1,5 M e 0,15 M per soluzione di percoll |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Programma U-033 utilizzato per l'elettroporazione dei globuli rossi | |
| Pipetta Pasteur | VWR | 14673-043 | |
| Penicillina/Streptomicina | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Gradiente di densità) | Cytivia | 17-0891-02 | Dettagli nel protocollo |
| PL0017 Plasmide | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pirimetamina (per somministrazione orale) | Sigma | 46706 | Dettagli di preparazione: Aggiungere 17,5 mg di pirimetamina a 2,5 mL di DMSO. Vortice, se necessario per sciogliersi completamente; Regolare il pH di 225 mL di dH2O a 4 utilizzando HCL. Aggiungere la pirimetamina in DMSO all'acqua e portare a 250 ml. Aggiungere 10 g di zucchero per incoraggiare il consumo regolare di acqua drogata. La pirimetamina è sensibile alla luce. Usa una bottiglia scura o una bottiglia ricoperta di foglio di alluminio quando tratti i topi. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Software per microscopia SoftWoRx | Precisione applicata | v6.1.3 |
Riferimenti
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al.
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Ristampe e permessi
