Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Summary

Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.

Abstract

Malaria ist eine tödliche Krankheit, die durch den Parasiten Plasmodium verursacht wird und durch den Stich weiblicher Anopheles-Mücken übertragen wird. Das Sporozoitenstadium von Plasmodium , das von Stechmücken in der Haut von Wirbeltierwirten abgelagert wird, durchläuft eine Phase der obligatorischen Entwicklung in der Leber, bevor die klinische Malaria beginnt. Wir wissen wenig über die Biologie der Plasmodienentwicklung in der Leber; Der Zugang zum Sporozoitenstadium und die Fähigkeit, solche Sporozoiten genetisch zu modifizieren, sind entscheidende Werkzeuge für die Untersuchung der Art der Plasmodium-Infektion und der daraus resultierenden Immunantwort in der Leber. In dieser Arbeit stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Generierung von transgenen Plasmodium berghei-Sporozoiten vor. Wir verändern P. berghei im Blutstadium genetisch und verwenden diese Form, um Anopheles-Mücken zu infizieren, wenn sie eine Blutmahlzeit zu sich nehmen. Nachdem sich die transgenen Parasiten in den Mücken entwickelt haben, isolieren wir das Sporozoitenstadium des Parasiten aus den Speicheldrüsen der Mücken für in vivo und in vitro Experimente. Wir demonstrieren die Validität des Protokolls durch die Generierung von Sporozoiten eines neuen Stammes von P. berghei , der die Untereinheit 11 (GFP₁₁) des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) exprimiert, und zeigen, wie es zur Untersuchung der Biologie der Malaria im Leberstadium verwendet werden kann.

Introduction

Trotz Fortschritten in der Entwicklung von Medikamenten und der Forschung zur Malariaprävention und -behandlung ist die weltweite Krankheitslast durch Malaria nach wie vor hoch. Mehr als eine halbe Million Menschen sterben jedes Jahr an Malaria, wobei die höchste Sterblichkeitsrate bei Kindern beobachtet wird, die in Malaria-endemischen Regionen wie Afrika südlich der Sahara leben¹. Malaria wird durch den Parasiten Plasmodium verursacht, der durch den Stich weiblicher Anopheles-Mücken, die den Parasiten in ihren Speicheldrüsen tragen, auf den Menschen übertragen wird. Das infektiöse Stadium der Plasmodien – die Sporozoiten – lagern sich während einer Blutmahlzeit in der Haut der Wirbeltierwirte ab und wandern durch den Blutkreislauf, um Leberzellen zu infizieren, wo sie sich vor der Infektion der Erythrozyten obligatorisch entwickeln (prä-erythrozytäre Malaria). Die Infektion der Erythrozyten löst das Blutstadium der Malaria aus und ist für die Gesamtheit der mit der Krankheit verbundenen Morbidität und Mortalität verantwortlich ^2,3.

Die obligate Natur der präerythrozytären Entwicklung von Plasmodium hat es zu einem attraktiven Ziel für die prophylaktische Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten gemacht⁴. Eine Voraussetzung für die Erforschung der Biologie der präerythrozytären Malaria sowie für die Entwicklung von Impfstoffen oder Medikamenten, die auf das Leberstadium abzielen, ist der Zugang zu Plasmodium-Sporozoiten. Darüber hinaus war unsere Fähigkeit, genetisch veränderte Plasmodium-Sporozoiten zu erzeugen, maßgeblich für den Erfolg solcher Forschungsbemühungen 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodiumlinien, die fluoreszierende oder lumineszierende Reporterproteine exprimieren, haben es uns ermöglicht, ihre Entwicklung in vivo und in vitro zu verfolgen ^10,11. Genetisch abgeschwächte Parasiten (GAPs), die durch die Deletion mehrerer Gene in Plasmodium erzeugt werden, gehören ebenfalls zu den vielversprechendsten Impfstoffkandidaten^12,13.

Malariamodelle von Nagetieren und nicht-menschlichen Primaten haben uns geholfen, die Mechanismen der Wirt-Parasiten-Interaktionen bei der menschlichen Malaria zu verstehen, da die Plasmodium-Arten Ähnlichkeiten in Biologie und Lebenszyklus aufweisen¹⁴. Die Verwendung von Plasmodium-Spezies, die Nagetiere, aber nicht den Menschen infizieren (z. B. P. berghei), ermöglicht die Aufrechterhaltung des gesamten Parasitenlebenszyklus und die Generierung infektiöser Sporozoiten für die Untersuchung von Malaria im Leberstadium in einer kontrollierten Umgebung der Biosicherheitsstufe 1. Für die Generierung von transgenen Plasmodium-Parasiten im Blutstadium¹⁵, die Infektion von Stechmücken¹⁶ und die Isolierung von Sporozoiten¹⁷ gibt es bereits eine Vielzahl separater Protokolle. In dieser Arbeit skizzieren wir ein umfassendes Protokoll, das diese Methoden kombiniert, um transgene P. berghei-Sporozoite am Beispiel des neuartigen transgenen Stammes PbGFP₁₁ zu generieren und zu isolieren. PbGFP 11 transportiert den 11. β-Strang des grün fluoreszierenden Super-Ordner-Proteins (GFP), GFP₁₁, in die parasitophore Vakuole (PV), die in den Wirtshepatozyten erzeugt wird. PbGFP₁₁ wird in Verbindung mit transgenen Hepatozyten (Hepa1-6-Hintergrund) verwendet, die Reste exprimieren, die das GFP 1-10-Fragment (GFP 1-10) im Zytoplasma bilden (Hepa-GFP-1-10-Zellen). PbGFP₁₁ berichtet über die PV-Lyse in den Wirtshepatozyten durch Selbstkomplementierung und die Neubildung von funktionellem GFP und dem grünen Fluoreszenzsignal¹⁸. Bemerkenswert ist, dass GFP 11 als eine Reihe von sieben Tandemsequenzen in PbGFP₁₁ kodiert ist, um das resultierende Fluoreszenzsignal zu verstärken. Durch die Färbung von PbGFP₁₁ Sporozoiten mit dem zytoplasmatischen Farbstoff CellTrace Violet (CTV) können wir die Parasiten verfolgen. Die Lyse solcher CTV-gefärbten intrazellulären Parasiten selbst führt zu einem Austritt von CTV in das Zytoplasma der Wirtszelle und zur Färbung der Wirtszelle. Neben der Visualisierung und Unterscheidung der Lyse von Plasmodium PV und/oder des Parasiten in Wirtshepatozyten kann dieses System zuverlässig verwendet werden, um die für einen dieser Prozesse verantwortlichen Immunwege durch die genetische oder therapeutische Störung der molekularen Komponenten solcher Signalwege zu untersuchen.

Protocol

Alle Forschungen mit Wirbeltieren in unserem Labor wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen der University of Georgia zur Verwendung von Tieren durchgeführt. 1. Generierung von P. berghei-infizierten Mäusen Initiierung einer Infektion im Blutstadium bei männlichen oder weiblichen, 6-8 Wochen alten C57BL/6 (B6)-Mäusen unter Verwendung von Wildtyp-P. berghei-Parasiten. Zu diesem Zweck wird kryokonserviertes P. berghei-in…

Representative Results

Die Bestimmung der Häufigkeit und Entwicklung von Schizonten ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich genügend lebensfähige Parasiten im optimalen Stadium für die Transfektion befinden. Unreife Schizonten können von voll ausgereiften Schizonten durch das Vorhandensein von weniger Merozoiten unterschieden werden, die nicht den gesamten intrazellulären Raum des Erythrozyten ausfüllen (Abbildung 1B). Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Herstellung von Blutausstrichen aus kult…

Discussion

Wir haben das obige Protokoll in unserem Labor verwendet, um mehrere Linien transgener P. berghei-Parasiten zu erzeugen. Obwohl dieses Protokoll für P. berghei optimiert ist, haben wir dieses Protokoll auch erfolgreich zur Generierung transgener P. yoelii-Sporozoite verwendet . Nach Injektion der transfizierten Schizonten in Mäuse sind die Parasiten in der Regel spätestens nach 3 d.p.i. in allen Gruppen nachweisbar, einschließlich der Kontrolle ohne Plasmid. Mit der Selektion wird erst bego…

Materials

30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II – Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3