आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करना

Summary

मलेरिया संक्रमित मच्छरों द्वारा प्लास्मोडियम के स्पोरोज़ोइट चरण के टीकाकरण के माध्यम से फैलता है। ट्रांसजेनिक प्लाज्मोडियम ने हमें मलेरिया के जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति दी है और मलेरिया वैक्सीन विकास प्रयासों में सीधे योगदान दिया है। यहां, हम ट्रांसजेनिक प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करने के लिए एक सुव्यवस्थित पद्धति का वर्णन करते हैं।

Abstract

मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम के कारण होने वाली एक घातक बीमारी है और मादा एनोफिलीज मच्छरों के काटने से फैलती है। कशेरुक मेजबानों की त्वचा में मच्छरों द्वारा जमा प्लास्मोडियम का स्पोरोज़ोइट चरण नैदानिक मलेरिया शुरू करने से पहले यकृत में अनिवार्य विकास के चरण से गुजरता है। हम यकृत में प्लास्मोडियम विकास के जीव विज्ञान के बारे में बहुत कम जानते हैं; स्पोरोज़ोइट चरण तक पहुंच और आनुवंशिक रूप से ऐसे स्पोरोज़ोइट्स को संशोधित करने की क्षमता प्लास्मोडियम संक्रमण की प्रकृति और यकृत में परिणामी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यहां, हम ट्रांसजेनिक प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स की पीढ़ी के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम आनुवंशिक रूप से रक्त-चरण पी बर्गेई को संशोधित करते हैं और इस रूप का उपयोग एनोफिलीज मच्छरों को संक्रमित करने के लिए करते हैं जब वे रक्त भोजन लेते हैं। मच्छरों में ट्रांसजेनिक परजीवी के विकास के बाद, हम विवो और इन विट्रो प्रयोग के लिए मच्छर लार ग्रंथियों से परजीवी के स्पोरोज़ोइट चरण को अलग करते हैं। हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) सबयूनिट 11 (जीएफपी₁₁) को व्यक्त करने वाले पी बर्गेई के एक नए स्ट्रेन के स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करके प्रोटोकॉल की वैधता का प्रदर्शन करते हैं, और दिखाते हैं कि यकृत-चरण मलेरिया के जीव विज्ञान की जांच के लिए इसका उपयोग कैसे किया जा सकता है।

Introduction

मलेरिया की रोकथाम और उपचार में दवा विकास और अनुसंधान में प्रगति के बावजूद, मलेरिया का वैश्विक रोग बोझ उच्च बना हुआ है। हर साल मलेरिया से पांच लाख से अधिक लोग मर जाते हैं, जिसमें मलेरिया-स्थानिक क्षेत्रों में रहने वाले बच्चों में मृत्यु दर का उच्चतम स्तर देखा जाता है, जैसे कि उप-सहारा अफ्रीका¹। मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम के कारण होता है, जो मादा एनोफिलीज मच्छरों के काटने से मनुष्यों में फैलता है, जो उनकी लार ग्रंथियों में परजीवी को सहन करते हैं। प्लास्मोडियम का संक्रामक चरण-स्पोरोज़ोइट्स-रक्त भोजन के दौरान कशेरुक मेजबानों की त्वचा में जमा होता है और यकृत कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए रक्तप्रवाह के माध्यम से यात्रा करता है, जहां वे एरिथ्रोसाइट्स को संक्रमित करने से पहले अनिवार्य विकास (पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक मलेरिया का गठन) से गुजरते हैं। एरिथ्रोसाइट्स का संक्रमण मलेरिया के रक्त-चरण को शुरू करता है^{और रोग से} जुड़ी रुग्णता और मृत्यु दर की संपूर्णता के लिए जिम्मेदार ^है।

प्लाज्मोडियम के पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक विकास की बाध्यकारी प्रकृति ने इसे रोगनिरोधी टीका और दवा^{विकास प्रयासों के} लिए एक आकर्षक लक्ष्य बना दिया है। प्री-एरिथ्रोसाइटिक मलेरिया के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के साथ-साथ यकृत चरण को लक्षित करने वाले टीकों या दवाओं के विकास के लिए एक शर्त प्लास्मोडियम स्पोरोज़ोइट्स तक पहुंच है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लास्मोडियम स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करने की हमारी क्षमता 5,6,7,8,9 ऐसे शोध प्रयासों की सफलता में सहायक रही है। फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट रिपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक प्लाज्मोडियम लाइनों ने हमें विवो और इन विट्रो^10,11 में उनके विकास को ट्रैक करने की अनुमति दी है। प्लास्मोडियम में कई जीनों के विलोपन के माध्यम से उत्पन्न आनुवंशिक रूप से क्षीण परजीवी (जीएपी) भी कुछ सबसे आशाजनक वैक्सीन उम्मीदवार^हैं।

कृंतक और गैर-मानव प्राइमेट मलेरिया मॉडल ने हमें प्लास्मोडियम ^{प्रजातियों के} बीच जीव विज्ञान और जीवन चक्र में समानता के कारण मानव मलेरिया में मेजबान-परजीवी बातचीत के तंत्र को समझने में मदद की है। प्लास्मोडियम प्रजातियों का उपयोग जो कृन्तकों को संक्रमित करता है, लेकिन मनुष्यों को नहीं (जैसे, पी बर्गेई) एक नियंत्रित, जैव सुरक्षा स्तर 1 सेटिंग में यकृत-चरण मलेरिया का अध्ययन करने के लिए पूर्ण परजीवी जीवन चक्र और संक्रामक स्पोरोज़ोइट्स की पीढ़ी के रखरखाव की अनुमति देता है। ट्रांसजेनिक रक्त-चरण प्लास्मोडियम परजीवी¹⁵, मच्छरों के संक्रमण¹⁶ और स्पोरोज़ोइट्स¹⁷ के अलगाव के लिए विभिन्न प्रकार के अलग-अलग प्रोटोकॉल पहले से ही मौजूद हैं। यहां, हम एक उदाहरण के रूप में नोवेल ट्रांसजेनिक स्ट्रेन पीबीजीएफपी₁₁ का उपयोग करते हुए, ट्रांसजेनिक पी बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स को उत्पन्न करने और अलग करने के लिए इन पद्धतियों के संयोजन के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। पीबीजीएफपी 11 सुपर-फ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), जीएफपी 11 के₁₁ वें β-स्ट्रैंड को मेजबान हेपेटोसाइट्स में उत्पन्न पैरासिटोफोरस रिक्तिका (पीवी) में ले जाता है। पीबीजीएफपी₁₁ का उपयोग ट्रांसजेनिक हेपेटोसाइट्स (हेपा 1-6 पृष्ठभूमि) के साथ संयोजन के रूप में किया जाता है जो अवशेषों को व्यक्त करता है जो साइटोप्लाज्म (हेपा जीएफपी 1-10 कोशिकाओं) में जीएफपी 1-10 टुकड़े (जीएफपी _1-10) का गठन करते हैं। पीबीजीएफपी₁₁ मेजबान हेपेटोसाइट्स में आत्म-पूरक और कार्यात्मक जीएफपी के सुधार और ग्रीन फ्लोरेसेंस सिग्नल¹⁸ के माध्यम से पीवी लाइसिस की रिपोर्ट करता है। ध्यान दें, जीएफपी 11 को परिणामी प्रतिदीप्ति संकेत को बढ़ाने के लिए पीबीजीएफपी₁₁ में सात अग्रानुक्रम अनुक्रमों की एक श्रृंखला के रूप में एन्कोड किया गया है। साइटोप्लाज्मिक डाई सेलट्रेस वायलेट (सीटीवी) के साथ पीबीजीएफपी₁₁ स्पोरोज़ोइट्स को धुंधला करने पर, हम परजीवियों को ट्रैक कर सकते हैं। इस तरह के सीटीवी-दाग वाले इंट्रासेल्युलर परजीवियों के लाइसिस के परिणामस्वरूप मेजबान सेल साइटोप्लाज्म में सीटीवी का रिसाव होता है और मेजबान सेल का धुंधलापन होता है। मेजबान हेपेटोसाइट्स में प्लास्मोडियम पीवी और / या परजीवी के लाइसिस को देखने और अलग करने के अलावा, इस प्रणाली का उपयोग ऐसे मार्गों के आणविक घटकों के आनुवंशिक या चिकित्सीय गड़बड़ी के माध्यम से इन प्रक्रियाओं में से किसी एक के लिए जिम्मेदार प्रतिरक्षा मार्गों का अध्ययन करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है।

Protocol

हमारी प्रयोगशाला में कशेरुक जानवरों को शामिल करने वाले सभी शोध जॉर्जिया विश्वविद्यालय पशु उपयोग दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुपालन में किए गए थे। 1. पी बर्गेई -संक्रमित चूहों की पी…

Representative Results

स्किज़ोन्ट्स की आवृत्ति और विकास का निर्धारण यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त व्यवहार्य परजीवी अभिकर्मक के लिए इष्टतम चरण में हैं। अपरिपक्व स्किज़ोन्ट्स को कम मेरोज़ोइट्स की उपस्…

Discussion

हमने ट्रांसजेनिक पी बर्गेई परजीवी की कई लाइनें बनाने के लिए हमारी प्रयोगशाला में उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। हालांकि पी बर्गेई के लिए अनुकूलित, हमने ट्रांसजेनिक पी योएली स्पोरोज़ो…

Materials

30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II – Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3