Генерация генетически модифицированных спорозоитов Plasmodium berghei
Summary
Малярия передается инфицированными комарами при инокуляции спорозоитной стадии плазмодия . Трансгенный плазмодий позволил нам лучше понять биологию малярии и внес непосредственный вклад в разработку вакцины против малярии. В данной статье мы опишем оптимизированную методологию получения трансгенных спорозоитов Plasmodium berghei .
Abstract
Малярия является смертельным заболеванием, вызываемым паразитом Plasmodium и передающимся через укусы самок комаров рода Anopheles . Спорозоитная стадия плазмодия , откладываемого комарами в коже позвоночных хозяев, проходит фазу обязательного развития в печени, прежде чем начать клиническую малярию. Мы мало знаем о биологии развития плазмодия в печени; доступ к стадии спорозоита и способность генетически модифицировать такие спорозоиты являются важнейшими инструментами для изучения природы инфекции Plasmodium и результирующего иммунного ответа в печени. Здесь мы представляем комплексный протокол генерации трансгенных спорозоитов Plasmodium berghei . Мы генетически модифицируем P. berghei в крови и используем эту форму для заражения комаров рода Anopheles , когда они едят кровь. После того, как трансгенные паразиты развиваются у комаров, мы выделяем спорозоитную стадию паразита из слюнных желез комаров для экспериментов in vivo и in vitro . Мы демонстрируем валидность протокола, генерируя спорозоиты нового штамма P. berghei , экспрессирующие субъединицу 11 зеленого флуоресцентного белка (GFP11), и показываем, как его можно использовать для исследования биологии малярии на стадии печени.
Introduction
Несмотря на успехи в разработке лекарств и научных исследованиях в области профилактики и лечения малярии, глобальное бремя малярии остается высоким. Ежегодно от малярии умирает более полумиллиона человек, при этом самые высокие уровни смертности наблюдаются среди детей, живущих в эндемичных по малярии регионах, таких как страны Африки к югу отСахары1. Малярия вызывается паразитом Plasmodium, который передается человеку через укусы самок комаров рода Anopheles, несущих паразита в своих слюнных железах. Инфекционная стадия плазмодия — спорозоиты — откладываются в коже позвоночных во время трапезы с кровью и путешествуют по кровотоку, чтобы заразить клетки печени, где они претерпевают обязательное развитие (составляющие преэритроцитарную малярию) до заражения эритроцитов. Инфекция эритроцитов инициирует стадию малярии в крови и ответственна за всю заболеваемость и смертность, связанные с этой болезнью 2,3.
Облигатный характер преэритроцитарного развития Plasmodium сделал его привлекательной мишенью для профилактических усилий по разработке вакцин и лекарств4. Обязательным условием для изучения биологии преэритроцитарной малярии, а также разработки вакцин или препаратов, нацеленных на стадию печени, является доступ к спорозоитам Plasmodium. Кроме того, наша способность генерировать генетически модифицированные спорозоиты Plasmodium сыграла важную роль в успехе таких исследований 5,6,7,8,9. Трансгенные линии плазмодия, экспрессирующие флуоресцентные или люминесцентные репортерные белки, позволили проследить их развитие in vivo и in vitro10,11. Генетически ослабленные паразиты (GAP), образующиеся в результате делеции нескольких генов в плазмодии, также являются одними из наиболее перспективных вакцин-кандидатов12,13.
Модели малярии грызунов и приматов помогли нам понять механизмы взаимодействия паразита-хозяина при малярии человека из-за сходства в биологии и жизненном цикле видов Plasmodium 14. Использование видов Plasmodium, которые заражают грызунов, но не человека (например, P. berghei), позволяет поддерживать полный жизненный цикл паразита и генерировать инфекционные спорозоиты для изучения малярии на стадии печени в контролируемых условиях с уровнем биобезопасности 1. В настоящее время существует множество отдельных протоколов для получения трансгенных паразитов Plasmodium 15 стадии крови, заражения комаров16 и выделения спорозоитов17. В этой статье мы излагаем комплексный протокол, объединяющий эти методологии для получения и изоляции трансгенных спорозоитов P. berghei, используя в качестве примера новый трансгенный штамм PbGFP11. PbGFP 11 транспортирует 11-ю β-цепочку супер-папки зеленого флуоресцентного белка (GFP), GFP11, в паразитофорную вакуоль (PV), образующуюся в гепатоцитах хозяина. PbGFP 11 используется совместно с трансгенными гепатоцитами (фон Hepa1-6), экспрессирующими остатки, составляющие фрагмент GFP 1-10 (GFP 1-10) в цитоплазме (клетки Hepa GFP 1-10). PbGFP11 сообщает о лизисе ФВ в гепатоцитах хозяина посредством самокомплементаризации и переформирования функционального GFP и зеленого флуоресцентного сигнала18. Следует отметить, что GFP 11 кодируется как серия из семи тандемных последовательностей в PbGFP11 для усиления результирующего флуоресцентного сигнала. Окрашивая спорозоиты PbGFP11 цитоплазматическим красителем CellTrace Violet (CTV), мы можем отследить паразитов. Лизис таких CTV-окрашенных внутриклеточных паразитов сам по себе приводит к утечке CTV в цитоплазму клетки-хозяина и окрашиванию клетки-хозяина. В дополнение к визуализации и дифференциации лизиса Plasmodium PV и/или паразита в гепатоцитах хозяина, эта система может быть надежно использована для изучения иммунных путей, ответственных за любой из этих процессов, посредством генетического или терапевтического возмущения молекулярных компонентов таких путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы использовали вышеописанный протокол в нашей лаборатории для создания нескольких линий трансгенных паразитов P. berghei. Несмотря на то, что этот протокол оптимизирован для P . berghei, мы также успешно использовали этот протокол для генерации трансгенных спорозоитов P. yoelii. По?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения AI168307 SPK. Мы благодарим UGA CTEGD Flow Cytometry Core и UGA CTEGD Microscopy Core. Мы также признательны Эшу Патхаку, Энн Эллиот и сотрудникам UGA Sporocore за вклад в оптимизацию протокола. Мы хотим поблагодарить д-ра Дайчи Камияма (Daichi Kamiyama) за ценные идеи, обсуждение и родительские плазмиды, содержащие GFP11 и GFP 1-10. Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Kurup за их постоянную поддержку, терпение и ободрение.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
Riferimenti
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
