LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가
Summary
이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.
Abstract
자가포식은 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 성분을 선택적으로 분해하는 특수한 이화 과정입니다. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다. 암세포는 저산소증, 영양 결핍 또는 화학 요법으로 인한 손상과 같은 불리한 조건에 적응하기 위해 자가포식 수준을 조절할 수 있습니다. 관 췌장 선암종은 가장 치명적인 유형의 암 중 하나입니다. 췌장암 세포는 자가포식 단백질의 전사 상향 조절 및 번역 후 활성화로 인해 높은 자가포식 활성을 가지고 있습니다.
여기서, 췌장 인간 암세포의 모델로 PANC-1 세포주를 사용하였고, 고도로 분화된 포유류 세포의 생리학적 모델로 AR42J 췌장 선엽 세포주를 사용하였다. 이 연구는 자가포식 활성화 상태의 지표로 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)의 면역형광을 사용했습니다. LC3는 기저 조건에서 세포질의 확산 분포 패턴을 나타내는 자가포식 단백질입니다(이 조건에서는 LC3-I로 알려짐). 자가포식 유도는 새로 형성된 자가포식소체 표면의 포스파티딜에탄올아민에 대한 LC3의 접합을 촉발하여 자가포식소체의 형성 및 확장을 돕는 막 결합 단백질인 LC3-II를 형성합니다. 라벨이 붙은 자가포식 구조의 수를 정량화하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 FIJI가 “3D Objects Counter” 도구를 사용하여 활용되었습니다.
생리적 조건과 암세포 모두에서 자가포식 수준을 측정하면 저산소증, 화학 요법 치료 또는 특정 단백질의 녹다운과 같은 다양한 조건에서 자가포식의 조절을 연구할 수 있습니다.
Introduction
Macroautophagy (일반적으로 autophagy라고 함)는 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 구성 요소를 선택적으로 분해하는 특수 이화 과정입니다 1,2. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리학적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다3. autophagy 동안, 이중 막 소포가 형성됩니다 : autophagosome. 자가포식소체는 화물 분자를 포함하고 분해를 위해 리소좀으로 유도합니다 1,4.
자가포식소체는 자가포식 단백질 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)5에 의해 장식됩니다. 자가포식이 유도되지 않을 때, LC3는 LC3-I 입체형태의 세포질 및 핵에서 확산된다. 한편, 자가포식이 유도되면, LC3은 자가포식 구조6의 막에서 포스파티딜에탄올아민과 접합된다. 이 새로운 LC3 형태는 LC3-II1로 알려져 있습니다. LC3 형태 이동은 세포 국소화 및 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 이동의 변화를 일으키며, 이는 면역형광 및 웨스턴 블롯 5,7과 같은 기술로 감지할 수 있습니다. 이러한 방식으로 LC3 접합은 자가포식 활성을 측정하는 데 사용할 수 있는 자가포식 과정의 핵심 이벤트입니다.
췌장 acinar 세포는 건강한 조건에서 자가포식 비율이 낮은 고도로 분화된 세포입니다. 그러나 다른 생리적 조건이나 약리학적 자극 하에서 자가포식을 활성화할 수 있습니다. 그러므로, 이 세포주에서 자가포식 수준의 측정은 자가포식에 대한 다양한 약리학적 또는 생물학적 제제의 잠재적인 직간접적인 효과를 연구하는 데 유용하다8,9.
유관 췌장 선암종은 진단이 늦고 화학요법 저항성이 높기 때문에 가장 치명적인 유형의 암 중 하나이다10. 췌장암 세포는 자가포식 관련 단백질의 전사 상향 조절 및 번역 후 활성화로 인해 높은 자가포식 활성을 갖는다11. 췌장암 세포는 저산소증, 영양 결핍 또는 화학 요법으로 인한 손상과 같은 불리한 조건에 반응하여 자가포식 수준을 조정할 수 있습니다11. 따라서 췌장암 세포의 자가포식 수준을 분석하면 다양한 환경에 적응하는 방법을 이해하고 자가포식 조절 치료의 효과를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 연구는 두 개의 별개의 췌장 세포 모델에서 LC3 면역형광을 수행하는 방법을 보여줍니다. 첫 번째 모델인 PANC-1 세포는 췌관 선암의 모델로 사용되었습니다. 이 세포는 이전에 자가포식을 유도하는 것으로 밝혀진 화학요법제인 젬시타빈으로 처리되었으며, 특히 발암성 Kirsten 쥐 육종 바이러스 유전자(KRAS)를 운반하는 췌장암 세포에서 12,13. 두 번째 모델인 AR42J 세포는 외분비 췌장 세포의 보다 생리학적 모델로 사용되었습니다. 이 세포들은 덱사메타손으로 분화되어 acinar pancreatic cells14와 더 유사해졌습니다. 이들 세포에서, 자가포식은 강력한 mTOR 억제제인 PP242의 사용을 통해 약리학적으로 유도되었다15. 이 연구에서 우리는 두 가지 다른 췌장 모델로 설명된 프로토콜의 적용 가능성과 낮은 자가포식 상태와 높은 자가포식 상태를 구별하는 능력을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 설명된 방법을 사용하면 세포 내 내인성 LC3 분포를 시각화하고 다양한 조건에서 자가포식 수준을 정량화할 수 있습니다. LC3 분포를 분석하고 자가포식 활성화를 결정하는 데 사용되는 또 다른 유사한 방법은 형광 표지된 LC3 형질감염(예: RFP-LC3)을 포함합니다19. RFP-LC3 형질감염은 고정을 필요로 하지 않고(이는 생세포 이미징(20)에서 이 방법을 적?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 부에노스 아이레스 대학교 (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), 국립 과학 연구 기술위원회 (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO 및 PUE 22920170100033) 및 국립 과학 기술 진흥기구 (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
Riferimenti
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