Summary

用于追踪斑马鱼径向胶质细胞祖细胞不对称分裂期间缺口/δ内吞作用的抗体摄取测定

Published: January 20, 2023
doi:

Summary

这项工作开发了一种抗体摄取测定法,用于在胚胎斑马鱼大脑的径向胶质细胞祖细胞分裂中成像谱系内Notch/DeltaD信号传导。

Abstract

不对称细胞分裂(ACD)产生两个不同命运的子细胞,是产生细胞多样性的基础。在无脊椎动物和脊椎动物的发育器官中,不对称分裂的祖先产生一个Notchhi 自我更新和一个Notchlo 差异化的女儿。在胚胎斑马鱼的大脑中,径向神经胶质细胞祖细胞(RGP) – 主要的脊椎动物神经干细胞 – 主要经历ACD以产生一个RGP和一个分化神经元。斑马鱼胚胎的光学清晰度和易于接近性使其成为 体内 延时成像的理想选择,以直接可视化在ACD期间如何以及何时建立Notch信号的不对称性。最近的研究表明,Notch配体DeltaD的动态内吞作用在ACD期间的细胞命运决定中起着至关重要的作用,并且该过程由进化上保守的极性调节剂Par-3(也称为Pard3)和动力蛋白运动复合物调节。为了可视化有丝分裂RGP中Notch信号内体的 体内 运输模式,我们开发了这种抗体摄取测定。使用该测定法,我们揭示了RGP分裂过程中含DeltaD的内体的动力学。

Introduction

Notch信号控制后生动物1发育过程中的细胞命运决定和模式,最近的研究表明,干细胞分裂中的Notch信号主要取决于内吞运输23。内吞Notch/Delta可以激活细胞核中的Notch信号传导并增强Notch靶基因456的转录。在果蝇感觉器官前体(SOP)细胞的不对称细胞分裂(ACD)过程中首次观察到定向Notch/Delta内体运输,导致pIIa中的Notch信号传导活性高于pIIb78。抗Delta和抗Notch抗体的抗体摄取测定已被应用于监测有丝分裂SOP细胞的内吞过程。Notch/DeltaD 内体在细胞分裂过程中与驱动蛋白一起移动到中心纺锤体,并且由于细胞分裂38 的最后一刻不对称中心纺锤体的反平行阵列而不对称地易位到 pIIa 细胞中。这些研究揭示了调节果蝇SOP细胞中不对称分裂的分子机制,但尚不清楚脊椎动物径向胶质细胞祖细胞(RGP)中是否发生类似的内吞过程。

此外,在脊椎动物RGP分裂过程中调节不对称Notch/DeltaD信号传导的分子机制尚不清楚。据报道,在斑马鱼中,Notch和Delta的相互作用促进了DeltaD配体9的内吞作用。目前尚不清楚DeltaD内吞作用是否会影响发育中的脊椎动物大脑中子细胞的细胞命运选择。最近的研究表明,将荧光偶联的抗DeltaD抗体注射到神经管中可以在神经上皮细胞中特异性标记Sara内体,并且含有Sara内体的抗DeltaD优先分离成增殖的子细胞10。有人提出,来自内体的Notch信号可以调节子细胞的命运。先前的结果表明,发育中的前脑中的大多数斑马鱼RGP细胞都会经历ACD,子细胞命运的确定取决于谱系内Notch/DeltaD信号传导11。为了阐明斑马鱼RGP中谱系内Notch/DeltaD信号传导的性质,我们开发了斑马鱼发育大脑中的抗DeltaD抗体摄取测定。使用该协议,我们已经成功地对有丝分裂RGP中的DeltaD内吞运输进行了活标记和成像。

荧光标记的抗 DeltaD 抗体沿前脑室有效内化到 RGP 中。它极大地促进了在不对称分裂的RGP中发现DeltaD内体的定向运输1213。与以前为果蝇培养物和斑马鱼脊髓 10 开发的抗体摄取方案相比,该方案在脑室细胞层中实现了持久高效的抗 DeltaD 标记,特别是微量注射的抗体混合物少于10 nL。后脑脑室注射对于在发育中的大脑中应用抗体摄取测定非常方便,因为后脑脑室在斑马鱼胚胎中扩增良好,并在早期发育阶段14充满脑脊液。通过将抗体混合物注射到后脑心室而不损伤任何关键的发育组织,该方案尽可能减少了对前脑成像区域的可能损害。注射一抗剂量的减少也避免了干扰 体内内源性Delta-Notch信号传导的潜在副作用。该协议可以很容易地与其他药理学或遗传扰动相结合,用于不同的发育阶段,并且可能适用于成人大脑以及人类多能干细胞衍生的2D / 3D脑类器官。综上所述,该协议使得理解在ACD期间如何以及何时建立Notch信号不对称成为可能。成功实施该方案的主要挑战是根据特定的实验条件精确输送适当浓度的抗体。

Protocol

我们使用AB野生型系和转基因株系 Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 进行研究。所有动物实验均获得美国加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准(批准文号:AN179000)。 1. 斑马鱼胚胎的制备 在下午5:00之前设置鱼穿越水箱,使用分隔器将一条雌性野生型鱼和一条雄性Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 鱼分开。 第二天早上上午 11:00 之前从?…

Representative Results

在 图2A中,注射Atto647N的胚胎不与一抗结合,在脑室中显示出背景荧光。在细胞中可以观察到很少的吞噬荧光颗粒。注射抗Dld-Atto647N的斑马鱼胚胎在发育中的前脑的大多数细胞中显示出大量内化的荧光颗粒(图2A,右图)。放大以聚焦有丝分裂RGP后,如图 2B所示,我们能够记录细胞内抗Dld-Atto647N内体在细胞分裂过程中的动态运动(…

Discussion

我们已经开发了一种抗体摄取测定法,用于高效标记和成像斑马鱼径向胶质细胞祖细胞的内体Notch/Delta运输。与以前用于追踪果蝇SOP细胞78中标记的抗DeltaD抗体的方法相比我们的方法使用显微注射而不是在偶联抗体中孵育样品。将荧光偶联的抗DLD抗体显微注射到后脑室;这种技术不会造成伤害,注射后胚胎的正常发育和完全恢复证明了这一点。胚胎脑…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

该项目得到了NIH R01NS120218,UCSF Mary Anne Koda-Kimble种子创新奖和Chan Zuckerberg Biohub的支持。

Materials

35mm glass bottom culture dish  MatTek corporation P35GC-1.5-10-C
air pressure injector  Narishige IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N  Sigma-Aldrich 50185
CaCl2.2H2 Sigma-Aldrich C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament World Precision Instruments 1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield Nikin N/A Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. 
Dumont Medical Tweezers Style 5 Thomas Scientific 72877-D
Flaming-Brown P897 puller Sutter Instruments N/A https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl Millipore 529552
MgSO4.7H2O Sigma-Aldrich M2773
micromanipulators World Precision Instruments WPI M3301R
Mouse anti-Dld  Abcam AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon Thermofisher Scientific Z25008
NaCl Sigma-Aldrich S3014
Phenol red Sigma-Aldrich P0290
Stemi 2000   Zeiss  N/A
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
UltraPureTM low melting point agarose  Invitrogen 16520050

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Zhao, X., Guo, S. Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors. J. Vis. Exp. (191), e65030, doi:10.3791/65030 (2023).

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