Ensaio de Captação de Anticorpos para Rastreamento de Endocitose Notch/Delta Durante a Divisão Assimétrica de Progenitores da Glia Radial de Zebrafish
Summary
Este trabalho desenvolve um ensaio de captação de anticorpos para obtenção de imagens da sinalização Notch/DeltaD intra-linhagem na divisão de progenitores radiais da glia do cérebro embrionário do peixe-zebra.
Abstract
A divisão celular assimétrica (DCA), que produz duas células-filhas de destinos diferentes, é fundamental para gerar diversidade celular. Nos órgãos em desenvolvimento de invertebrados e vertebrados, a divisão assimétrica dos progenitores gera um Notchhi auto-renovador e um Notchlo diferenciando-se. No cérebro embrionário do peixe-zebra, os progenitores radiais da glia (RGPs) – as principais células-tronco neurais dos vertebrados – são submetidos principalmente à DCA para dar origem a um RGP e um neurônio diferenciador. A clareza óptica e a fácil acessibilidade dos embriões de peixe-zebra os tornam ideais para imagens in vivo de lapso de tempo para visualizar diretamente como e quando a assimetria da sinalização Notch é estabelecida durante a DCA. Estudos recentes têm mostrado que a endocitose dinâmica do ligante Notch DeltaD desempenha um papel crucial na determinação do destino celular durante a DAC, e o processo é regulado pelo regulador de polaridade conservado evolutivamente Par-3 (também conhecido como Pard3) e pelo complexo motor dineína. Para visualizar os padrões de tráfego in vivo de endossomos de sinalização de Notch em RGPs mitóticos, desenvolvemos este ensaio de captação de anticorpos. Usando o ensaio, descobrimos a dinamicidade dos endossomos contendo DeltaD durante a divisão do RGP.
Introduction
A sinalização Notch controla a decisão e padronização do destino celular durante o desenvolvimento em metazoários1, e estudos recentes têm mostrado que a sinalização Notch na divisão de células-tronco depende principalmente do tráfego endocítico 2,3. O Notch endocitosado/Delta pode ativar a sinalização Notch no núcleo e aumentar a transcrição de genes alvo Notch 4,5,6. O tráfego endossômico Notch/Delta direcional foi observado pela primeira vez em células precursoras de órgãos sensoriais (SOP) de Drosophila durante sua divisão celular assimétrica (ACD), resultando em uma maior atividade de sinalização Notch em pIIa do que em pIIb 7,8. Ensaios de captação de anticorpos com anticorpos anti-Delta e anti-Notch têm sido aplicados para monitorar o processo endocítico em células POP mitóticas. Os endossomos Notch/DeltaD movem-se juntamente com uma proteína motora de cinesina para o fuso central durante a citocinese, e são translocados assimetricamente para dentro da célula pIIa devido à matriz antiparalela do fuso central assimétrico no último momento da divisão celular 3,8. Esses estudos lançaram luz sobre os mecanismos moleculares que regulam a divisão assimétrica em células de Drosophila SOP, mas não está claro se processos endocíticos semelhantes ocorrem em progenitores da glia radial de vertebrados (RGPs).
Além disso, os mecanismos moleculares que regulam a sinalização assimétrica Notch/DeltaD durante a divisão do RGP dos vertebrados não são bem compreendidos. Em zebrafish, tem sido relatado que a interação de Notch e Delta facilita a endocitose do ligante DeltaD9. Não se sabe se a endocitose DeltaD pode afetar a escolha do destino celular das células filhas no cérebro de vertebrados em desenvolvimento. Estudos recentes mostram que a injeção de anticorpos anti-DeltaD conjugados fluorescentemente no tubo neural poderia marcar os endossomos de Sara especificamente em células neuroepiteliais, e os endossomos anti-DeltaD contendo Sara segregam preferencialmente em células filhas em proliferação10. Tem sido sugerido que a sinalização de Notch dos endossomos poderia regular o destino das células filhas. Resultados anteriores mostraram que a maioria das células RGP do peixe-zebra no prosencéfalo em desenvolvimento sofre DCA, e a determinação do destino da célula filha é dependente da sinalização intralinhagem Notch/DeltaD11. A fim de elucidar a natureza da sinalização Notch/DeltaD intralinhagem em RGPs de peixe-zebra, desenvolvemos o ensaio de captação de anticorpos anti-DeltaD no cérebro em desenvolvimento do peixe-zebra. Usando este protocolo, realizamos com sucesso a marcação ao vivo e imagens do tráfego endocítico de DeltaD em RGPs mitóticos.
O anticorpo anti-DeltaD fluorescentemente marcado é eficientemente internalizado nos RGPs ao longo do ventrículo prosencéfalo. Isso facilitou sobremaneira a descoberta do tráfego direcional de endossomos DeltaD nos RGPs de divisão assimétrica12,13. Em comparação com protocolos anteriores de captação de anticorpos desenvolvidos para culturas de Drosophila notum e medula espinhal de peixe-zebra 10, este protocolo alcançou marcação anti-DeltaD de longa duração e altamente eficiente na camada de células do ventrículo cerebral, especificamente com menos de10 nL de mistura de anticorpos microinjetados. A injeção do ventrículo do rombencéfalo é muito conveniente para a aplicação do ensaio de captação de anticorpos no cérebro em desenvolvimento, pois o ventrículo do rombencéfalo é bem expandido em embriões de peixe-zebra e preenchido com líquido cefalorraquidiano no estágio inicial de desenvolvimento14. Ao injetar a mistura de anticorpos no ventrículo do rombencéfalo sem ferir nenhum tecido crucial em desenvolvimento, o protocolo minimizou ao máximo possíveis danos à zona de imagem no prosencéfalo. A dose reduzida do anticorpo primário injetado também evitou potenciais efeitos colaterais de interferir com a sinalização endógena Delta-Notch in vivo. Este protocolo pode ser facilmente combinado com outras perturbações farmacológicas ou genéticas, utilizado em diferentes estágios de desenvolvimento, e possivelmente adaptado ao cérebro adulto, bem como organoides cerebrais 2D/3D derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Em conjunto, o protocolo possibilitou entender como e quando a assimetria de sinalização de Notch é estabelecida durante a DCA. O principal desafio para a implementação bem-sucedida deste protocolo é alcançar a entrega precisa de concentrações apropriadas do anticorpo com base em condições experimentais específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos um ensaio de captação de anticorpos para marcação e obtenção de imagens endossômicas do tráfico de Notch/Delta em progenitores radiais da glia de peixe-zebra com alta eficiência. Em comparação com métodos anteriores usados para rastrear anticorpos marcados anti-DeltaD em células Drosophila SOP7,8, nosso método usou microinjeção em vez de incubação de amostras no anticorpo conjugado. Anticorpos anti-Dld conjugados fluorescentemente …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto foi apoiado pelo NIH R01NS120218, pelo UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation e pelo Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
Riferimenti
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