Ensemble liposome assisté par octanol sur puce pour la bio-ingénierie

Summary

Le présent protocole décrit l’assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA), une technique microfluidique pour générer des liposomes biocompatibles. OLA produit des liposomes monodispersés de la taille d’un micron avec une encapsulation efficace, permettant une expérimentation immédiate sur puce. Ce protocole devrait être particulièrement adapté à la biologie synthétique et à la recherche sur les cellules synthétiques.

Abstract

La microfluidique est un outil largement utilisé pour générer des gouttelettes et des vésicules de divers types de manière contrôlée et à haut débit. Les liposomes sont des imitations cellulaires simplistes composées d’un intérieur aqueux entouré d’une bicouche lipidique; Ils sont précieux pour concevoir des cellules synthétiques et comprendre les principes fondamentaux des cellules biologiques de manière in vitro et sont importants pour les sciences appliquées, telles que la livraison de fret pour des applications thérapeutiques. Cet article décrit un protocole de travail détaillé pour une technique microfluidique sur puce, l’assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA), pour produire des liposomes biocompatibles monodispersés de la taille d’un micron. L’OLA fonctionne de la même manière que le soufflage de bulles, où une phase aqueuse interne (IA) et une phase 1-octanol transportant des lipides environnants sont pincées par des flux de fluides externes contenant du surfactant. Cela génère facilement des gouttelettes à double émulsion avec des poches d’octanol saillantes. Au fur et à mesure que la bicouche lipidique s’assemble à l’interface des gouttelettes, la poche se détache spontanément pour donner naissance à un liposome unilamellaire prêt à être manipulé et expérimenté. L’OLA offre plusieurs avantages, tels que la génération régulière de liposomes (>10 Hz), l’encapsulation efficace des biomatériaux et les populations de liposomes monodispersés, et nécessite de très petits volumes d’échantillons (~ 50 μL), ce qui peut être crucial lorsque l’on travaille avec des produits biologiques précieux. L’étude comprend des détails sur la microfabrication, la lithographie douce et la passivation de surface, qui sont nécessaires pour établir la technologie OLA en laboratoire. Une application de preuve de principe en biologie synthétique est également démontrée en induisant la formation de condensats biomoléculaires à l’intérieur des liposomes via un flux transmembranaire de protons. On s’attend à ce que ce protocole vidéo d’accompagnement facilite l’établissement et le dépannage de l’OLA dans leurs laboratoires.

Introduction

Toutes les cellules ont une membrane plasmique comme limite physique, et cette membrane est essentiellement un échafaudage sous la forme d’une bicouche lipidique formée par l’auto-assemblage de molécules lipidiques amphiphiles. Les liposomes sont les contreparties synthétiques minimales des cellules biologiques; Ils ont une lumière aqueuse entourée de phospholipides, qui forment une bicouche lipidique avec les groupes de tête hydrophiles face à la phase aqueuse et les queues hydrophobes enfouies vers l’intérieur. La stabilité des liposomes est régie par l’effet hydrophobe, ainsi que par l’hydrophilie entre les groupes polaires, les forces de van der Waals entre les queues de carbone hydrophobes, et la liaison hydrogène entre les molécules d’eau et les têtes hydrophiles ^1,2. Selon le nombre de bicouches lipidiques, les liposomes peuvent être classés en deux catégories principales, à savoir les vésicules unilamellaires comprenant une seule bicouche et les vésicules multilamellaires construites à partir de plusieurs bicouches. Les vésicules unilamellaires sont en outre classées en fonction de leur taille. De forme typiquement sphérique, ils peuvent être produits dans une variété de tailles, y compris de petites vésicules unilamellaires (SUV, 30-100 nm de diamètre), de grandes vésicules unilamellaires (LUV, 100-1 000 nm de diamètre) et enfin, des vésicules unilamellaires géantes (GUV, >1 000 nm de diamètre)^3,4. Diverses techniques ont été développées pour produire des liposomes, et celles-ci peuvent être classées en grandes catégories en techniques de vrac⁵ et techniques microfluidiques⁶. Les techniques de vrac couramment pratiquées comprennent la réhydratation du film lipidique, l’électroformation, le transfert d’émulsion inversée et l’extrusion 7,8,9,10. Ces techniques sont relativement simples et efficaces, et ce sont les principales raisons de leur utilisation répandue dans la communauté de la biologie synthétique. Cependant, en même temps, ils souffrent d’inconvénients majeurs en ce qui concerne la polydispersité en taille, le manque de contrôle de la lamellarité et la faible efficacité d’encapsulation ^7,11. Des techniques telles que l’encapsulation continue par croisement d’interface de gouttelettes (cDICE)¹² et le tir par gouttelettes et la filtration granulométrique (DSSF)¹³ surmontent ces limites dans une certaine mesure.

Les approches microfluidiques ont pris de l’importance au cours de la dernière décennie. La technologie microfluidique fournit un environnement contrôlable pour manipuler les écoulements de fluides dans les microcanaux définis par l’utilisateur en raison du flux laminaire caractéristique et du transfert de masse dominé par diffusion. Les dispositifs de laboratoire sur puce qui en résultent offrent des possibilités uniques pour le contrôle spatio-temporel des molécules, avec des volumes d’échantillons considérablement réduits et des capacités de multiplexage¹⁴. De nombreuses méthodes microfluidiques pour fabriquer des liposomes ont été développées, notamment le jet pulsé 15, le templage à double émulsion 16, l’éjection membranaire transitoire 17, le transfert d’émulsion de gouttelettes 18 et la focalisation hydrodynamique ¹⁹. Ces techniques produisent des liposomes monodispersés, unilamellaires, de la taille d’une cellule, avec une efficacité d’encapsulation élevée et un débit élevé.

Cet article détaille la procédure d’assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA), une méthode microfluidique sur puce basée sur le mécanisme de pincement hydrodynamique et de mouillage ultérieur^{par solvant 20} (Figure 1). On peut relier le fonctionnement de l’OLA à un processus de soufflage de bulles. Une jonction à six voies concentre la phase aqueuse interne (IA), deux flux organiques porteurs de lipides (LO) et deux flux aqueux externes (OA) contenant des tensioactifs en un seul endroit. Il en résulte des gouttelettes à double émulsion eau dans (lipides + octanol) dans l’eau. Au fur et à mesure que ces gouttelettes s’écoulent en aval, la minimisation de l’énergie interfaciale, le flux de cisaillement externe et l’interaction avec les parois du canal conduisent à la formation d’une bicouche lipidique à l’interface lorsque la poche de solvant se détache, formant ainsi des liposomes unilamellaires. Selon la taille de la poche d’octanol, le processus de démoulage peut prendre de quelques dizaines à quelques minutes. À la fin du canal de sortie, les gouttelettes d’octanol moins denses flottent à la surface, tandis que les liposomes plus lourds (en raison d’une solution encapsulée plus dense) coulent au fond de la chambre de visualisation prêts à être expérimentés. En tant qu’expérience représentative, le processus de séparation en phase liquide-liquide (LLPS) à l’intérieur des liposomes est démontré. Pour cela, les composants requis sont encapsulés à l’intérieur des liposomes à un pH acide qui empêche LLPS. En déclenchant à l’extérieur un changement de pH et, par conséquent, un flux transmembranaire de protons, des gouttelettes de condensat séparées en phase se forment à l’intérieur des liposomes. Cela met en évidence les capacités efficaces d’encapsulation et de manipulation du système OLA.

Protocol

1. Fabrication de la plaquette maîtresse Prenez une plaquette de silicium propre de 4 po (10 cm) de diamètre (voir le tableau des matériaux). Nettoyez-le davantage en utilisant de l’air sous pression pour éliminer les particules de poussière. Montez la plaquette sur une enrobeuse de spin et distribuez doucement ~5 mL d’une résine photosensible négative (voir Tableau des matériaux) au centre de la plaquette. Essayez d’éviter les bulles d…

Representative Results

Cette étude démontre la formation de condensats sans membrane via le processus de séparation en phase liquide-liquide (LLPS) à l’intérieur des liposomes en tant qu’expérience représentative. Préparation des échantillonsL’IA, OA, ES et la solution d’alimentation (FS) sont préparés comme suit: IA : 12 % glycérol, 5 mM de dextran, 150 mM de KCl, 5 mg/mL de poly-L-lysine (PLL), 0,05 mg/mL de poly-L-lysine-FITC marqué (P…

Discussion

La complexité cellulaire rend extrêmement difficile la compréhension des cellules vivantes lorsqu’elles sont étudiées dans leur ensemble. Réduire la redondance et l’interconnectivité des cellules en reconstituant les composants clés in vitro est nécessaire pour approfondir notre compréhension des systèmes biologiques et créer des imitations cellulaires artificielles pour des applications biotechnologiques^22,23,24…

Materials

1-Octanol	Sigma-Aldrich	No. 297887
1.5 mL tubes	Fisher scientific	10451043	Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP	Sigma-Aldrich	No. A2383
Biopsy punch	Darwin microfluidics	PT-T983-05	0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base	Sigma-Aldrich	No. 71405
Dextran	Sigma-Aldrich	No. 31388	Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine	Durham Magneto Optics Ltd	MicroWriter ML3 Baby	setup and software
DOPC lipid	Avanti	SKU:850375C
F68	Sigma-Aldrich	No. 24040032
Glass cover slip	Corning	#1, 24 x 40 mm
Glycerol	Sigma-Aldrich	No. G2025
Hydrochloric acid	Thermo Scientific Acros	No. 124630010
Liss Rhod PE lipid	Avanti	SKU:810150C
Parafilm	Sigma-Aldrich	No. P7793
Photoresist	Micro resist technology GmbH	EpoCore 10
Photoresist developer	micro resist technology GmbH	mr-Dev 600
Plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G
Polydimethylsiloxane	Dow	Sylgard 184	PDMS and curing agent
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled	Sigma-Aldrich	No. P3543
Polyvinyl alcohol	Sigma-Aldrich	no. P8136	molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller	Elveflow	OBK1 Mk3+	Flow controller
Scotch tape	Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer	Silicon Materials	0620R16002
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers	Darwin microfluidics	PN-BEN-23G
Tris-base	Sigma-Aldrich	No. 252859
Tygon tubing	Darwin microfluidics	1/16" OD x 0.02" ID
UV laser			365 nm wavelength