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Bioingegneria

생명공학을 위한 온칩 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65032
, ,
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter,Wageningen University & Research

Summary

본 프로토콜은 생체적합성 리포솜을 생성하기 위한 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)를 설명합니다. OLA는 효율적인 캡슐화를 통해 단분산 미크론 크기의 리포솜을 생산하여 즉각적인 온칩 실험이 가능합니다. 이 프로토콜은 합성 생물학 및 합성 세포 연구에 특히 적합할 것으로 예상됩니다.

Abstract

Microfluidics는 제어되고 높은 처리량 방식으로 다양한 종류의 액적과 소포를 생성하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 리포솜은 지질 이중층으로 둘러싸인 수성 내부로 구성된 단순한 세포 모조물입니다. 이들은 합성 세포를 설계하고 체외 방식으로 생물학적 세포의 기초를 이해하는 데 유용하며 치료 응용 분야를 위한 화물 운송과 같은 응용 과학에 중요합니다. 이 기사에서는 단분산, 미크론 크기, 생체 적합성 리포솜을 생산하기 위한 온칩 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)에 대한 자세한 작업 프로토콜에 대해 설명합니다. OLA는 내부 수성(IA) 상과 주변 지질 운반 1-옥탄올 상이 계면활성제 함유 외부 유체 흐름에 의해 끼워지는 버블 블로잉과 유사하게 기능합니다. 이것은 돌출된 옥탄올 포켓이 있는 이중 에멀젼 방울을 쉽게 생성합니다. 지질 이중층이 액적 계면에서 조립됨에 따라 포켓이 자발적으로 분리되어 추가 조작 및 실험이 가능한 단일 라멜라 리포솜이 생성됩니다. OLA는 꾸준한 리포솜 생성(>10Hz), 생체 재료의 효율적인 캡슐화, 단분산 리포솜 모집단과 같은 몇 가지 이점을 제공하며 매우 적은 양의 샘플(~50μL)이 필요하므로 귀중한 생물학적 제제로 작업할 때 중요할 수 있습니다. 이 연구에는 실험실에서 OLA 기술을 확립하는 데 필요한 미세 가공, 소프트 리소그래피 및 표면 패시베이션에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다. 원리 증명 합성 생물학 응용 프로그램은 막횡단 양성자 플럭스를 통해 리포솜 내부에 생체 분자 응축물의 형성을 유도함으로써 보여집니다. 이 함께 제공되는 비디오 프로토콜은 독자가 실험실에서 OLA를 설정하고 문제를 해결하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

Introduction

모든 세포는 물리적 경계로서 원형질막을 가지고 있으며, 이 막은 본질적으로 양친매성 지질 분자의 자가 조립에 의해 형성된 지질 이중층 형태의 스캐폴드입니다. 리포솜은 생물학적 세포의 최소 합성 대응물입니다. 그들은 인지질로 둘러싸인 수성 루멘을 가지고 있으며, 이는 친수성 헤드 그룹이 수성 상을 향하고 소수성 꼬리가 안쪽으로 묻혀있는 지질 이중층을 형성합니다. 리포솜의 안정성은 소수성 효과뿐만 아니라 극성기 사이의 친수성, 소수성 탄소 꼬리 사이의 반 데르 발스 힘, 물 분자와 친수성 헤드 사이의 수소 결합 1,2에 의해 결정됩니다. 지질 이중층의 수에 따라, 리포솜은 두 가지 주요 범주, 즉 단일 이중층을 포함하는 단층 소포 및 다중 이중층으로 구성된 다층 소포로 분류될 수 있습니다. Unilamellar 소포는 크기에 따라 추가로 분류됩니다. 일반적으로 구형이며 작은 단층 소포(SUV, 직경 30-100nm), 큰 단층 소포(LUV, 직경 100-1,000nm), 마지막으로 거대 단층 소포(GUV, 직경 >1,000nm)3,4. 리포좀을 생산하기 위해 다양한 기술이 개발되었으며, 이들은 크게 벌크 기술5과 미세유체 기술6로 분류할 수 있다. 일반적으로 실행되는 벌크 기술에는 지질 필름 재수화, 전기 형성, 도립 에멀젼 전사 및 압출 7,8,9,10이 포함됩니다. 이러한 기술은 비교적 간단하고 효과적이며 합성 생물학 커뮤니티에서 널리 사용되는 주된 이유입니다. 그러나, 동시에, 이들은 크기의 다분산성, 층상에 대한 제어의 결여, 및 낮은 캡슐화 효율 7,11과 관련하여 주요한 단점을 안고 있다. 연속 액적 계면 교차 캡슐화(cDICE)12 및 액적 촬영 및 크기 여과(DSSF)13와 같은 기술은 이러한 한계를 어느 정도 극복합니다.

미세 유체 접근법은 지난 10년 동안 두각을 나타내고 있습니다. 미세 유체 기술은 특징적인 층류 및 확산 지배적 인 물질 전달로 인해 사용자 정의 마이크로 채널 내에서 유체 흐름을 조작하기위한 제어 가능한 환경을 제공합니다. 그 결과 랩온어칩(lab-on-a-chip) 장치는 분자의 시공간 제어를 위한 고유한 가능성을 제공하며, 시료 부피를 크게 줄이고 다중화 기능을 제공합니다(14). 리포좀을 만들기 위한 수많은 미세유체 방법들이 개발되었는데, 펄스 분사(pulsed jetting)15, 이중 에멀젼 템플릿(double emulsion templating)16, 일시적인 막 분출(transient membrane ejection)17, 액적 에멀젼 전달(droplet emulsion transfer)18, 유체역학적 포커싱(hydrodynamic focusing)19 등이 있다. 이러한 기술은 높은 캡슐화 효율과 높은 처리량을 가진 단분산, 단층, 세포 크기의 리포솜을 생산합니다.

이 기사에서는 유체역학적 핀치 오프 및 후속 용매 탈습윤 메커니즘20을 기반으로 하는 온칩 미세유체 방법인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)에 대한 절차를 자세히 설명합니다(그림 1). OLA의 작동을 버블 블로잉 프로세스와 관련시킬 수 있습니다. 6방향 접합부는 내부 수성(IA) 상, 2개의 지질 운반 유기(LO) 스트림 및 2개의 계면활성제 함유 외부 수성(OA) 스트림을 단일 지점에 집중시킵니다. 그 결과 수중수(지질 + 옥탄올)수중 이중 에멀젼 방울이 생성됩니다. 이러한 액적이 하류로 흐를 때 계면 에너지 최소화, 외부 전단 흐름 및 채널 벽과의 상호 작용으로 인해 용매 포켓이 분리되어 단층 리포솜이 형성됨에 따라 계면에 지질 이중층이 형성됩니다. 옥탄올 포켓의 크기에 따라 디웨팅 과정은 수십 초에서 몇 분이 소요될 수 있습니다. 출구 채널의 끝에서 밀도가 낮은 옥탄올 방울이 표면으로 떠오르는 반면, 더 무거운 리포솜(더 조밀한 캡슐화 용액으로 인해)은 실험 준비가 된 시각화 챔버의 바닥으로 가라앉습니다. 대표적인 실험으로 리포좀 내부의 액체-액체 상분리(LLPS) 과정을 시연합니다. 이를 위해 필요한 성분은 LLPS를 방지하는 산성 pH에서 리포솜 내부에 캡슐화됩니다. 외부에서 pH 변화를 유발하여 막횡단 양성자 플럭스를 유발함으로써 리포솜 내부에 상분리된 응축물 방울이 형성됩니다. 이것은 OLA 시스템의 효과적인 캡슐화 및 조작 기능을 강조합니다.

Protocol

1. 마스터 웨이퍼 제작 직경 4cm(10인치)의 깨끗한 실리콘 웨이퍼를 사용합니다( 재료 표 참조). 먼지 입자를 제거하기 위해 압축 공기를 사용하여 추가로 청소하십시오. 스핀 코터에 웨이퍼를 장착하고 웨이퍼 중앙에 ~5mL의 네거티브 포토레지스트( 재료 표 참조)를 부드럽게 분배합니다. 기포는 웨이퍼의 다운스트림 인쇄 프로세스를 방해할 수 ?…

Representative Results

본 연구는 대표적인 실험으로 리포좀 내부의 액체-액체 상분리(LLPS) 과정을 통해 멤브레인을 사용하지 않는 응축수를 형성하는 것을 보여줍니다. 시료 전처리IA, OA, ES 및 사료 용액(FS)은 다음과 같이 준비됩니다. IA: 12% 글리세롤, 5mM 덱스트란, 150mM KCl, 5mg/mL 폴리-L-라이신(PLL), 0.05mg/mL 폴리-L-라이신-FITC 표지(PLL-FITC), 8mM 아데노신 삼인산…

Discussion

세포 복잡성은 전체적으로 연구할 때 살아있는 세포를 이해하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 시험관 내에서 주요 구성 요소를 재구성하여 세포의 중복성 및 상호 연결성을 줄이는 것은 생물학적 시스템에 대한 이해를 높이고 생명 공학 응용 분야를 위한 인공 세포 모방을 만드는 데 필요합니다22,23,24. 리포솜은 세포 현상을 이…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

YFP를 친절하게 제공해 주신 Dolf Weijers, Vera Gorelova, Mark Roosjen 님께 감사드립니다. S.D.는 네덜란드 연구위원회 (보조금 번호 : OCENW. 클라인.465).

Materials

1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).
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