Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

Summary

O presente protocolo descreve a montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), uma técnica microfluídica para gerar lipossomas biocompatíveis. O OLA produz lipossomas monodispersos do tamanho de mícrons com encapsulamento eficiente, permitindo a experimentação imediata no chip. Prevê-se que este protocolo seja particularmente adequado para biologia sintética e pesquisa de células sintéticas.

Abstract

A microfluídica é uma ferramenta amplamente utilizada para gerar gotículas e vesículas de vários tipos de forma controlada e de alto rendimento. Os lipossomas são miméticos celulares simplistas compostos por um interior aquoso circundado por uma bicamada lipídica; Eles são valiosos para projetar células sintéticas e entender os fundamentos das células biológicas de forma in vitro e são importantes para ciências aplicadas, como a entrega de carga para aplicações terapêuticas. Este artigo descreve um protocolo de trabalho detalhado para uma técnica microfluídica on-chip, montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), para produzir lipossomas biocompatíveis monodispersos, de tamanho micron. O OLA funciona de forma semelhante ao sopro de bolhas, onde uma fase aquosa interna (IA) e uma fase adjacente de 1-octanol carreadora de lipídios são pinçadas por fluxos de fluido externo contendo surfactante. Isso gera prontamente gotículas de emulsão dupla com bolsas de octanol salientes. À medida que a bicamada lipídica se reúne na interface da gota, a bolsa se desprende espontaneamente para dar origem a um lipossomo unilamelar que está pronto para posterior manipulação e experimentação. O OLA oferece várias vantagens, como geração constante de lipossomas (>10 Hz), encapsulamento eficiente de biomateriais e populações de lipossomas monodispersas, e requer volumes de amostra muito pequenos (~50 μL), o que pode ser crucial quando se trabalha com biológicos preciosos. O estudo inclui detalhes sobre microfabricação, litografia suave e passivação de superfície, que são necessários para estabelecer a tecnologia OLA no laboratório. Uma aplicação da biologia sintética de prova de princípio também é mostrada induzindo a formação de condensados biomoleculares dentro dos lipossomas via fluxo de prótons transmembrana. Espera-se que este protocolo de vídeo que o acompanha facilitará aos leitores estabelecer e solucionar problemas de OLA em seus laboratórios.

Introduction

Todas as células têm uma membrana plasmática como limite físico, e esta membrana é essencialmente um arcabouço na forma de uma bicamada lipídica formada pela auto-montagem de moléculas lipídicas anfifílicas. Os lipossomas são as contrapartes sintéticas mínimas das células biológicas; Possuem lúmen aquoso circundado por fosfolipídios, que formam uma bicamada lipídica com os grupos de cabeças hidrofílicas voltadas para a fase aquosa e as caudas hidrofóbicas enterradas para dentro. A estabilidade dos lipossomas é governada pelo efeito hidrofóbico, assim como pela hidrofilicidade entre os grupos polares, forças de van der Waals entre as caudas de carbono hidrofóbicas e a ligação de hidrogênio entre as moléculas de água e as cabeças hidrofílicas ^1,2. Dependendo do número de bicamadas lipídicas, os lipossomas podem ser classificados em duas categorias principais: vesículas unilamelares compostas por uma única bicamada e vesículas multilamelares construídas a partir de múltiplas bicamadas. As vesículas unilamelares são ainda classificadas com base em seus tamanhos. De forma tipicamente esférica, podem ser produzidas em uma variedade de tamanhos, incluindo pequenas vesículas unilamelares (SUV, diâmetro de 30-100 nm), grandes vesículas unilamelares (LUV, diâmetro de 100-1.000 nm) e, finalmente, vesículas unilamelares gigantes (GUV, >diâmetro de 1.000 nm)^3,4. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de lipossomas, e estas podem ser amplamente categorizadas^{em técnicas de} massa5 e técnicas microfluídicas6. Técnicas de massa comumente praticadas incluem reidratação de filme lipídico, eletroformação, transferência de emulsão invertida e extrusão 7,8,9,10. Estas técnicas são relativamente simples e eficazes, e estas são as principais razões para o seu uso generalizado na comunidade de biologia sintética. No entanto, ao mesmo tempo, sofrem de grandes desvantagens no que diz respeito à polidispersidade de tamanho, à falta de controle sobre a lamelaridade e à baixa eficiência de encapsulação ^7,11. Técnicas como continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE)¹² e droplet shooting and size filtration (DSSF)¹³ superam essas limitações até certo ponto.

As abordagens microfluídicas têm ganhado destaque na última década. A tecnologia microfluídica fornece um ambiente controlável para manipular fluxos de fluidos dentro de microcanais definidos pelo usuário devido ao fluxo laminar característico e à transferência de massa dominada por difusão. Os dispositivos lab-on-a-chip resultantes oferecem possibilidades únicas para o controle espaço-temporal de moléculas, com volumes de amostra significativamente reduzidos e capacidade de multiplexação¹⁴. Numerosos métodos microfluídicos para fazer lipossomas foram desenvolvidos, incluindo jato pulsado 15, modelagem de emulsão dupla 16, ejeção de membrana transitória 17, transferência de emulsão em gotícula¹⁸ e focalização hidrodinâmica ¹⁹. Essas técnicas produzem lipossomas monodispersos, unilamelares do tamanho de células com alta eficiência de encapsulação e alto rendimento.

Este artigo detalha o procedimento de montagem de lipossomas assistidos por octanol (OLA), um método microfluídico on-chip baseado no pinch-off hidrodinâmico e subsequente mecanismo de desidratação do solvente²⁰ (Figura 1). Pode-se relacionar o funcionamento do OLA a um processo de explosão de bolhas. Uma junção de seis vias concentra a fase aquosa interna (IA), duas correntes orgânicas carreadoras de lipídios (LO) e duas correntes aquosas externas (OA) contendo surfactante em um único ponto. Isso resulta em gotículas de emulsão dupla água-em-(lipídios + octanol)-em-água. À medida que essas gotículas fluem rio abaixo, a minimização da energia interfacial, o fluxo de cisalhamento externo e a interação com as paredes do canal levam à formação de uma bicamada lipídica na interface à medida que a bolsa de solvente se desprende, formando assim lipossomas unilamelares. Dependendo do tamanho do bolso octanol, o processo de desumectação pode levar de dezenas de segundos a alguns minutos. No final do canal de saída, as gotículas octanol menos densas flutuam para a superfície, enquanto os lipossomas mais pesados (devido a uma solução encapsulada mais densa) afundam no fundo da câmara de visualização prontos para experimentação. Como um experimento representativo, o processo de separação de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de lipossomas é demonstrado. Para isso, os componentes necessários são encapsulados dentro de lipossomas a um pH ácido que impede a LLPS. Ao desencadear externamente uma mudança de pH e, portanto, um fluxo transmembrana de prótons, gotículas de condensado separadas por fase são formadas dentro dos lipossomas. Isso destaca os recursos efetivos de encapsulamento e manipulação do sistema OLA.

Protocol

1. Fabricação do wafer mestre Pegue um wafer de silicone limpo de 4 polegadas (10 cm) de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais). Limpe-o ainda mais usando ar pressurizado para remover quaisquer partículas de poeira. Monte o wafer em um revestidor de spin e distribua suavemente ~5 mL de um fotorresiste negativo (consulte a Tabela de Materiais) no centro do wafer. Tente evitar bolhas de ar, pois elas podem interferir no processo de impressão a j…

Representative Results

Este estudo demonstra a formação de condensados sem membrana através do processo de separação de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de lipossomas como um experimento representativo. Preparo da amostraO IA, OA, ES e a solução de alimentação (FS) são preparados da seguinte forma: IA: glicerol a 12%, dextrana 5 mM, KCl 150 mM, poli-L-lisina (PLL) a 5 mg/mL, poli-L-lisina-FITC marcada com 0,05 mg/mL (PLL-FITC), trifosfato de ade…

Discussion

A complexidade celular torna extremamente difícil entender as células vivas quando estudadas como um todo. Reduzir a redundância e a interconectividade das células por meio da reconstituição in vitro dos componentes-chave é necessário para aprofundar o entendimento dos sistemas biológicos e criar mímica celular artificial para aplicações biotecnológicas^22,23,24. Os lipossomas servem como um excelente sistema mínimo…

Materials

1-Octanol	Sigma-Aldrich	No. 297887
1.5 mL tubes	Fisher scientific	10451043	Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP	Sigma-Aldrich	No. A2383
Biopsy punch	Darwin microfluidics	PT-T983-05	0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base	Sigma-Aldrich	No. 71405
Dextran	Sigma-Aldrich	No. 31388	Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine	Durham Magneto Optics Ltd	MicroWriter ML3 Baby	setup and software
DOPC lipid	Avanti	SKU:850375C
F68	Sigma-Aldrich	No. 24040032
Glass cover slip	Corning	#1, 24 x 40 mm
Glycerol	Sigma-Aldrich	No. G2025
Hydrochloric acid	Thermo Scientific Acros	No. 124630010
Liss Rhod PE lipid	Avanti	SKU:810150C
Parafilm	Sigma-Aldrich	No. P7793
Photoresist	Micro resist technology GmbH	EpoCore 10
Photoresist developer	micro resist technology GmbH	mr-Dev 600
Plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G
Polydimethylsiloxane	Dow	Sylgard 184	PDMS and curing agent
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled	Sigma-Aldrich	No. P3543
Polyvinyl alcohol	Sigma-Aldrich	no. P8136	molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller	Elveflow	OBK1 Mk3+	Flow controller
Scotch tape	Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer	Silicon Materials	0620R16002
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers	Darwin microfluidics	PN-BEN-23G
Tris-base	Sigma-Aldrich	No. 252859
Tygon tubing	Darwin microfluidics	1/16" OD x 0.02" ID
UV laser			365 nm wavelength