On-chip oktanolassisterad liposommontering för bioteknik
Summary
Detta protokoll beskriver oktanolassisterad liposommontering (OLA), en mikrofluidisk teknik för att generera biokompatibla liposomer. OLA producerar monodispergerade liposomer i mikronstorlek med effektiv inkapsling, vilket möjliggör omedelbar experiment på chipet. Detta protokoll förväntas vara särskilt lämpligt för syntetisk biologi och syntetisk cellforskning.
Abstract
Mikrofluidik är ett allmänt använt verktyg för att generera droppar och vesiklar av olika slag på ett kontrollerat och högt genomströmningssätt. Liposomer är förenklade cellulära efterlikningar som består av ett vattenhaltigt inre omgivet av ett lipid-dubbelskikt; De är värdefulla för att designa syntetiska celler och förstå grunden för biologiska celler på ett in vitro-sätt och är viktiga för tillämpad vetenskap, såsom lastleverans för terapeutiska tillämpningar. Den här artikeln beskriver ett detaljerat arbetsprotokoll för en mikrofluidisk teknik på chipet, oktanolassisterad liposommontering (OLA), för att producera monodispergerade, mikronstora, biokompatibla liposomer. OLA fungerar på samma sätt som bubbelblåsning, där en inre vattenhaltig (IA) fas och en omgivande lipidbärande 1-oktanolfas kläms av av ytaktiva yttre vätskeströmmar. Detta genererar lätt droppar med dubbel emulsion med utskjutande oktanolfickor. När lipid-dubbelskiktet monteras vid droppgränssnittet lossnar fickan spontant för att ge upphov till en unilamellär liposom som är redo för ytterligare manipulation och experiment. OLA ger flera fördelar, såsom stadig liposomgenerering (>10 Hz), effektiv inkapsling av biomaterial och monodisperserade liposompopulationer, och kräver mycket små provvolymer (~ 50 μL), vilket kan vara avgörande när man arbetar med värdefulla biologiska ämnen. Studien innehåller detaljer om mikrofabrikation, mjuklitografi och ytpassivering, som behövs för att etablera OLA-tekniken i labbet. En proof-of-principle syntetisk biologiapplikation visas också genom att inducera bildandet av biomolekylära kondensat inuti liposomerna via transmembranprotonflöde. Det förväntas att detta medföljande videoprotokoll kommer att underlätta läsarna att upprätta och felsöka OLA i sina laboratorier.
Introduction
Alla celler har ett plasmamembran som sin fysiska gräns, och detta membran är i huvudsak en byggnadsställning i form av ett lipid-dubbelskikt bildat genom självmontering av amfifila lipidmolekyler. Liposomer är de minimala syntetiska motsvarigheterna till biologiska celler; De har en vattenhaltig lumen omgiven av fosfolipider, som bildar ett lipid-dubbelskikt med de hydrofila huvudgrupperna vända mot vattenfasen och de hydrofoba svansarna begravda inåt. Liposomernas stabilitet styrs av den hydrofoba effekten, liksom hydrofiliciteten mellan de polära grupperna, van der Waals-krafterna mellan de hydrofoba kolsvansarna och vätebindningen mellan vattenmolekyler och de hydrofila huvudena 1,2. Beroende på antalet lipidbilager kan liposomer klassificeras i två huvudkategorier, nämligen unilamellära vesiklar innefattande ett enda dubbelskikt och multilamellära vesiklar konstruerade av flera dubbelskikt. Unilamellar vesiklar klassificeras vidare baserat på deras storlekar. De är vanligtvis sfäriska i form och kan tillverkas i olika storlekar, inklusive små unilamellära vesiklar (SUV, 30-100 nm diameter), stora unilamellar vesiklar (LUV, 100-1,000 nm diameter) och slutligen jätte unilamellar vesiklar (GUV, >1,000 nm diameter)3,4. Olika tekniker har utvecklats för att producera liposomer, och dessa kan kategoriseras brett i bulktekniker5 och mikrofluidiska tekniker6. Vanligen praktiserade bulktekniker inkluderar lipidfilmrehydrering, elektroformation, inverterad emulsionsöverföring och extrudering 7,8,9,10. Dessa tekniker är relativt enkla och effektiva, och dessa är de främsta orsakerna till deras utbredda användning i syntetisk biologi samhället. Samtidigt lider de emellertid av stora nackdelar med avseende på polydispersiteten i storlek, bristen på kontroll över lamellariteten och låg inkapslingseffektivitet 7,11. Tekniker som kontinuerlig droplet interface crossing encapsulation (cDICE)12 och droppskytte och storleksfiltrering (DSSF)13 övervinner dessa begränsningar i viss utsträckning.
Mikrofluidiska metoder har blivit allt mer framträdande under det senaste decenniet. Mikrofluidisk teknik ger en kontrollerbar miljö för att manipulera vätskeflöden inom användardefinierade mikrokanaler på grund av det karakteristiska laminära flödet och diffusionsdominerad massöverföring. De resulterande lab-on-a-chip-enheterna erbjuder unika möjligheter för spatiotemporal kontroll av molekyler, med avsevärt reducerade provvolymer och multiplexeringskapacitet14. Många mikrofluidiska metoder för att göra liposomer har utvecklats, inklusive pulsad jetting15, dubbel emulsionsmall 16, transient membranutkastning 17, droppemulsionsöverföring 18 och hydrodynamisk fokusering 19. Dessa tekniker producerar monodispergerade, unilamellära, cellstora liposomer med hög inkapslingseffektivitet och hög genomströmning.
Denna artikel beskriver proceduren för oktanolassisterad liposommontering (OLA), en mikrofluidisk metod på chip baserad på den hydrodynamiska avklämningen och efterföljande lösningsmedelsvätningsmekanism20 (figur 1). Man kan relatera OLA:s arbete till en bubbelblåsningsprocess. En sexvägskorsning fokuserar den inre vattenhaltiga (IA) fasen, två lipidbärande organiska (LO) strömmar och två ytaktiva innehållande yttre vattenhaltiga (OA) strömmar på en enda plats. Detta resulterar i vatten-i-(lipider + oktanol)-i-vatten dubbla emulsionsdroppar. När dessa droppar flyter nedströms leder minimering av gränssnittsenergi, externt skjuvflöde och interaktion med kanalväggarna till bildandet av ett lipid-dubbelskikt vid gränssnittet när lösningsmedelsfickan lossnar och därmed bildar unilamellär liposom. Beroende på storleken på oktanolfickan kan avfuktningsprocessen ta tiotals sekunder till ett par minuter. I slutet av utgångskanalen flyter de mindre täta oktanoldropparna till ytan, medan de tyngre liposomerna (på grund av en tätare inkapslad lösning) sjunker till botten av visualiseringskammaren redo för experiment. Som ett representativt experiment demonstreras processen för vätske-vätskefasseparation (LLPS) inuti liposomer. För detta är de nödvändiga komponenterna inkapslade inuti liposomer vid ett surt pH som förhindrar LLPS. Genom att externt utlösa en pH-förändring och därmed ett transmembranprotonflöde bildas fasseparerade kondensatdroppar inuti liposomerna. Detta belyser OLA-systemets effektiva inkapslings- och manipuleringsförmåga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellulär komplexitet gör det extremt svårt att förstå levande celler när de studeras som helhet. Att minska redundans och sammankoppling av celler genom att rekonstituera nyckelkomponenterna in vitro är nödvändigt för att öka vår förståelse av biologiska system och skapa artificiella cellulära efterlikningar för biotekniska tillämpningar22,23,24. Liposomer fungerar som ett utmärkt minimalt system för att förs…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dolf Weijers, Vera Gorelova och Mark Roosjen för vänligheten att förse oss med YFP. S.D. erkänner ekonomiskt stöd från det nederländska forskningsrådet (bidragsnummer: OCENW. KLEIN.465).
Materials
| 1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
| 1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
| ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
| Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
| Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
| Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
| DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
| F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
| Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
| Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
| Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
| Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
| Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
| Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
| Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
| Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
| Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
| Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
| Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
| Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
| UV laser | 365 nm wavelength |
Riferimenti
- Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
- Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
- Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
- Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
- Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
- van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
- Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
- Zhang, H., D’Souza, G. G. M. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. , 17-22 (2017).
- Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
- Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
- Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
- Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
- Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
- Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
- Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
- Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
- Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
- Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
- Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
- Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
- Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
- Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
- Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
- Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
- Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
- Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
- Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
- Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
- Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
- Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
- Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
- Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
- Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
- Banlaki, I., Lehr, F. -. X., Niederholtmeyer, H., Karim, A. S., Jewett, M. C. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. , 237-255 (2022).
